Этот протокол показывает, как мы собрали и охарактеризовали слой за слоем JBNm на молекулярном уровне. JBNm инкапсулирует TGF-B1 и предотвращает его высвобождение в окружающие ткани, тем самым способствуя локализованному хондрогенезу. Формирование JBNm стандартизировано, что позволяет формировать различные JBNm для будущих применений.
Уникальная послойная структура позволяет инкапсуляцию фактора роста, создавая устойчивое локализованное высвобождение, что позволяет избежать гипертрофии и поддерживать рост. JBNm обеспечивает гомеостатическое микросредование для регенерации хрящевой ткани в ограниченном месте из-за его инъекционной способности, которая может быть использована для различных сценариев, таких как переломы неправильной формы или полости. Для начала добавьте восемь микролитров по одному миллиграмму на миллилитр TGF-B1, суспендированных в воде до 32 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр Матрилина-3, взвешенного в воде.
Пипетка для обеспечения правильного перемешивания этих белков. Добавьте 80 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр. Нанотрубки Janus Base, или JBNts, взвешенные в воде, в растворе TGF-B1, Matrilin-3.
Пипетка многократно для обеспечения правильного смешивания. Для группы JBNt добавьте пять микролитров по одному миллиграмму на миллилитр, JBNts к 50 микролитрам воды, чтобы получить 90,9 микрограмм на миллилитр раствора. Для группы Матрилин-3 добавьте 40 микролитров по 10 мкг на миллилитр Матрилина-3 до 15 микролитров воды, чтобы получить 7,3 мкг на миллилитр раствора.
Для группы TGF-B1 добавьте 10 микролитров по 10 микрограммов на миллилитр, TGF-B1 к 45 микролитрам воды, чтобы получить 1,8 микрограмма на миллилитр раствора. Для наноматрики Janus Base или группы JBNm добавьте 40 микролитров по 10 микрограммов на миллилитр, матрилин-3 до 10 микролитров по 10 микрограммов на миллилитр TGF-B1. Перемешайте, чтобы обеспечить правильное перемешивание.
Затем добавьте к раствору пять микролитров по одному миллиграмму на миллилитр JBNts, многократно пипетируя для смешивания образца. С помощью спектрофотометра измерьте спектр поглощения каждой группы. Маркировка TGF-B1 с помощью набора для маркировки белка в соответствии с инструкциями производителя.
Добавьте 20 микролитров по 20 микрограммов на миллилитр, помеченных TGF-B1, к 25 микролитрам воды, чтобы получить 8,9 микрограмма на миллилитр тестового раствора. Маркировка Matrilin-3 с помощью отдельного набора для маркировки. Добавьте 20 микролитров по 80 микрограмм на миллилитр с маркировкой Matrilin-3 до 25 микролитров воды, чтобы получить 36 микрограмм на миллилитр тестового раствора.
Смешайте 20 микролитров по 80 микрограммов на миллилитр с маркировкой Matrilin-3 с 20 микролитрами по 20 микрограммов на миллилитр с маркировкой TGF-B1 и пятью микролитрами воды, в результате чего получится меченое соединение TGF-B1, Matrilin-3. Пипетку смесь несколько раз перемешать. Добавьте пять микролитров по одному миллиграмму на миллилитр JBNts к 40 микролитрам воды, в результате чего получится 111 микрограмм на миллилитр раствора.
Затем добавляют пять микролитров по одному миллиграмму на миллилитр JBNts к меченому раствору TGF-B1, Matrilin-3 и многократно пипетку для смешивания соединения. Перенесите каждую группу образцов в скважину черной плиты 384 скважины. Загрузите пластину в многомодовый считыватель микропластин и проведите измерения на длинах волн возбуждения 488 и 555 нанометров в соответствии с протоколами производителя.
В физиологических условиях спектр дзета-потенциала Матрилина-3 был отрицательно заряжен из-за его изоэлектрической точки. После добавления TGF-B1 к Matrilin-3 дзета-потенциал соединения TGF-B1 Matrilin-3 увеличился до почти нейтрального значения. Дзета-потенциал JBNm был самым высоким среди трех групп.
Спектры видимого поглощения УФ подтвердили формирование иерархического слоя за слоем внутренней структуры JBNm, ароматических колец боковых цепей лизина, а JBNts способствовали пикам поглощения на 220 и 280 нанометрах соответственно. TEM использовался для характеристики морфологии JBNts и JBNm. После объединения с белками наблюдались толстые пучки JBNm, образующие структуру каркаса.
Флуоресцентная микроскопия подтвердила наличие послойной структуры и продемонстрировала поперечное сечение JBNm. После маркировки красный флуоресцентный Матрилин-3 окутал пучки JBNt и сформировал внешний слой JBNm, в то время как зеленый флуоресцентный TGF-B1 образовал внутренний слой. Флуоресцентный резонансный перенос энергии показал пики излучения на уровне 520 нанометров для меченых групп TGF-B1 и 570 нанометров для групп Matrilin-3.
Было исследовано влияние JBNm на адгезию HMSC и пролиферацию клеток. JBNm показал, что HMSC сгруппированы вместе с самим собой, тогда как меньше ячеек придерживались JBNts. Выравнивание клеток и размер клеток на JBNm продемонстрировали, что JBNts играют роль в клеточной адгезии, в то время как белки увеличивают сродство клеточной адгезии.
После первого дня клеточной культуры группы JBNm и TGF-B1 показали значительную пролиферацию клеток по сравнению с другими группами. Когда продолжительность клеточной структуры была увеличена до трех и пяти дней, группы JBNm и TGF-B1 продемонстрировали еще более повышенную пролиферацию клеток. При флуоресцентной маркировке JBNm важно, чтобы TGF-B1 и Matrilin-3 были индивидуально маркированы и смешаны перед добавлением JBNts, чтобы обеспечить правильное формирование структуры слоя за слоем.
Дальнейшая оценка каркасов может дать понимание того, насколько они эффективны в терапевтических методах лечения. Более конкретно, высокопроизводительный анализ пролиферации, может определить оптимальную дозировку in vitro, а затем in vivo. Это новое создание NanoMatriX позволяет исследователям использовать инъекционный каркас на основе наноматериала для регенерации хряща.
Этот подход, основанный на поли имитации, позволяет усилить андрогенез и противостоять пролиферации сайта.
