يوضح هذا البروتوكول كيف قمنا بتجميع وتوصيف الطبقة بطبقة JBNm على المستوى الجزيئي. JBNm يغلف TGF-B1 ، ويمنع إطلاقه في الأنسجة المحيطة ، وبالتالي تعزيز تكوين الغضروف الموضعي. يتم توحيد تشكيل JBNm ، مما يسمح بتشكيل JBNms مختلفة للتطبيقات المستقبلية.
تسمح البنية الفريدة من الطبقة تلو الأخرى بتغليف عامل النمو ، مما يخلق إطلاقا موضعيا ثابتا ، يتجنب التضخم ، ويحافظ على النمو. يوفر JBNm بيئة مجهرية استتبابية لتجديد أنسجة الغضاريف ، داخل مكان ضيق ، بسبب قابليته للحقن ، والتي يمكن استخدامها لسيناريوهات مختلفة ، مثل الكسور أو التجاويف غير المنتظمة الشكل. للبدء ، أضف ثمانية ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر TGF-B1 ، معلقة في الماء إلى 32 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر Matrilin-3 معلقة في الماء.
ماصة لضمان الخلط السليم لهذه البروتينات. أضف 80 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر. أنابيب جانوس النانوية الأساسية، أو JBNts المعلقة في الماء، إلى محلول TGF-B1 وMatrilin-3.
ماصة بشكل متكرر لضمان المزج السليم. بالنسبة لمجموعة JBNt ، أضف خمسة ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر ، JBNts إلى 50 ميكرولتر من الماء لصنع محلول 90.9 ميكروغرام لكل ملليلتر. بالنسبة لمجموعة Matrilin-3 ، أضف 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر Matrilin-3 إلى 15 ميكرولتر من الماء ، لصنع محلول 7.3 ميكروغرام لكل ملليلتر.
بالنسبة لمجموعة TGF-B1 ، أضف 10 ميكرولترات من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر ، من TGF-B1 إلى 45 ميكرولتر من الماء ، لصنع محلول 1.8 ميكروغرام لكل ملليلتر. بالنسبة لمجموعة Janus Base Nano-Matrix أو JBNm ، أضف 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر ، Matrilin-3 إلى 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر TGF-B1. حرض لضمان الخلط السليم.
ثم ، أضف خمسة ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر JBNts إلى المحلول ، وسحب السحب بشكل متكرر لخلط العينة. باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس طيف الامتصاص لكل مجموعة. قم بتسمية TGF-B1 باستخدام مجموعة ملصقات البروتين، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
أضف 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام لكل ملليلتر ، المسمى TGF-B1 ، إلى 25 ميكرولتر من الماء ، لصنع محلول اختبار 8.9 ميكروغرام لكل ملليلتر. قم بتسمية Matrilin-3 باستخدام مجموعة ملصقات منفصلة. أضف 20 ميكرولتر من 80 ميكروغرام لكل ملليلتر يحمل علامة Matrilin-3 إلى 25 ميكرولتر من الماء ، لصنع محلول اختبار 36 ميكروغرام لكل ملليلتر.
امزج 20 ميكرولتر من 80 ميكروغرام لكل ملليلتر يحمل اسم Matrilin-3 مع 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام لكل ملليلتر يحمل علامة TGF-B1 ، وخمسة ميكرولترات من الماء ، مما أدى إلى مركب TGF-B1 ، Matrilin-3 المسمى . ماصة الخليط عدة مرات للخلط. أضف خمسة ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر JBNts إلى 40 ميكرولتر من الماء ، مما يؤدي إلى 111 ميكروغرام لكل محلول ملليلتر.
ثم أضف خمسة ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر JBNts إلى محلول TGF-B1 المسمى ، Matrilin-3 ، وماصة بشكل متكرر لخلط المركب. انقل كل مجموعة عينة إلى بئر صفيحة بئر سوداء 384. قم بتحميل اللوحة في قارئ microplate متعدد الأوضاع ، وخذ قياسات بأطوال موجية مثيرة تبلغ 488 و 555 نانومتر باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة.
في ظل الظروف الفسيولوجية ، كان طيف زيتا المحتمل ل Matrilin-3 مشحونا سالبا بسبب نقطته المتساوية الكهربية. بعد إضافة TGF-B1 إلى Matrilin-3 ، زادت إمكانات زيتا لمركب TGF-B1 Matrilin-3 إلى قيمة شبه محايدة. كانت إمكانات زيتا ل JBNm هي الأعلى بين المجموعات الثلاث.
أكدت أطياف الامتصاص المرئي للأشعة فوق البنفسجية تكوين الطبقة الهرمية حسب البنية الداخلية للطبقة من JBNm ، والحلقات العطرية للسلاسل الجانبية لليسين ، و JBNts ساهمت في قمم الامتصاص ، عند 220 و 280 نانومتر على التوالي. تم استخدام TEM لتوصيف مورفولوجيا JBNts و JBNm. بعد الاندماج مع البروتينات ، لوحظت حزم سميكة من JBNm تشكل بنية سقالة.
أكد المجهر الفلوري وجود الطبقة حسب بنية الطبقة ، وأظهر المقطع العرضي ل JBNm. بعد وضع العلامات على الفلورسنت الأحمر Matrilin-3 ، غلف حزم JBNt ، وشكل الطبقة الخارجية من JBNm ، في حين شكل الفلورسنت الأخضر TGF-B1 طبقة داخلية. أظهر نقل طاقة الرنين الفلوري قمم الانبعاثات عند 520 نانومتر لمجموعات TGF-B1 المسماة ، و 570 نانومتر لمجموعات Matrilin-3.
تم استكشاف تأثير JBNm على التصاق HMSC وتكاثر الخلايا. أظهر JBNm أن HMSCs تتجمع جنبا إلى جنب مع نفسها ، في حين أن عددا أقل من الخلايا التزمت ب JBNts. أظهرت محاذاة الخلايا ، وحجم الخلايا على JBNm أن JBNts لعبت دورا في التصاق الخلايا ، في حين زادت البروتينات من تقارب التصاق الخلايا.
بعد اليوم الأول من زراعة الخلايا ، أظهرت مجموعات JBNm و TGF-B1 تكاثرا كبيرا للخلايا مقارنة بالمجموعات الأخرى. عندما تم زيادة مدة بنية الخلية إلى ثلاثة وخمسة أيام ، أظهرت مجموعات JBNm و TGF-B1 زيادة أكبر في انتشار الخلايا. عند وضع العلامات الفلورية على JBNm ، من المهم أن يتم تصنيف TGF-B1 و Matrilin-3 بشكل فردي وخلطهما قبل إضافة JBNts ، للسماح بالتكوين السليم للطبقة حسب بنية الطبقة.
يمكن أن يوفر التقييم الإضافي للسقالة فهما لكيفية فعاليتها في العلاجات العلاجية. وبشكل أكثر تحديدا ، يمكن لفحص الانتشار عالي الإنتاجية ، تحديد الجرعة المثلى في المختبر ، وبعد ذلك في الجسم الحي. يسمح هذا الإبداع الجديد NanoMatriX للباحثين باستخدام سقالة قابلة للحقن تعتمد على المواد النانوية لتجديد الغضروف.
يسمح نهج المحاكاة المتعددة هذا بتعزيز تكوين الأندروجينيسيس والانتشار المضاد للموقع.
