이 프로토콜은 분자 수준에서 JBNm을 층별로 조립하고 특성화하는 방법을 보여줍니다. JBNm은 TGF-B1을 캡슐화하고 주변 조직에서의 방출을 방지하여 국소 연골 생성을 촉진합니다. JBNm의 형성은 표준화되어 향후 응용 프로그램을 위해 다양한 JBN을 형성 할 수 있습니다.
층별 고유한 구조는 성장 인자 캡슐화를 허용하여 꾸준한 국소화 방출을 생성하여 비대를 피하고 성장을 유지합니다. JBNm은 불규칙한 모양의 골절이나 충치와 같은 다양한 시나리오에 사용할 수 있는 주사성으로 인해 제한된 위치 내에서 연골 조직 재생을 위한 항상성 미세 환경을 제공합니다. 시작하려면 물에 현탁 된 밀리리터 TGF-B1 당 1 밀리그램 8 마이크로 리터를 물에 현탁 된 1 밀리리터 Matrilin-3 당 32 마이크로 리터에 첨가하십시오.
이러한 단백질의 적절한 혼합을 보장하는 피펫. 밀리리터당 1 밀리그램의 80 마이크로 리터를 추가하십시오. 야누스베이스 나노 튜브 또는 JBNts를 물에 현탁하여 TGF-B1, Matrilin-3 용액에 첨가합니다.
적절한 혼합을 위해 반복적으로 피펫팅하십시오. JBNt 그룹의 경우 밀리리터당 1밀리그램의 5마이크로리터, 50마이크로리터의 물에 JBNts를 추가하여 밀리리터당 90.9마이크로그램 용액을 만듭니다. Matrilin-3 그룹의 경우 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 40 마이크로 리터 Matrilin-3을 15 마이크로 리터의 물에 추가하여 밀리리터 당 7.3 마이크로 그램의 용액을 만듭니다.
TGF-B1 그룹의 경우 밀리리터당 10마이크로리터의 TGF-B1을 물 45마이크로리터에 10마이크로리터씩 추가하여 밀리리터당 1.8마이크로그램의 용액을 만듭니다. 야누스베이스 나노 매트릭스 또는 JBNm 그룹의 경우 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 40 마이크로 리터, 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 Matrilin-3 내지 10 마이크로 리터 TGF-B1을 추가하십시오. 적절한 혼합을 보장하기 위해 교반하십시오.
그런 다음 JBNts 밀리리터당 1밀리그램의 5마이크로리터를 용액에 첨가하고 반복적으로 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다. 분광 광도계를 사용하여 각 그룹의 흡수 스펙트럼을 측정합니다. 제조업체의 지침에 따라 단백질 라벨링 키트를 사용하여 TGF-B1에 라벨을 붙입니다.
TGF-B1이라고 표시된 밀리리터당 20마이크로그램 20마이크로리터를 물 25마이크로리터에 추가하여 밀리리터당 8.9마이크로그램의 테스트 용액을 만듭니다. 별도의 라벨링 키트를 사용하여 Matrilin-3에 라벨을 붙입니다. 20 마이크로 리터의 물 25 마이크로 리터에 Matrilin-3 라벨이 붙은 밀리리터 당 80 마이크로 그램의 물을 추가하여 밀리리터 당 36 마이크로 그램의 테스트 용액을 만듭니다.
20 마이크로 리터의 밀리리터 당 80 마이크로 그램의 매트 릴린 -3을 TGF-B1로 표지 된 밀리리터 당 20 마이크로 그램의 20 마이크로 리터 및 5 마이크로 리터의 물과 혼합하여 표지 된 TGF-B1, Matrilin-3 화합물을 만듭니다. 혼합물을 여러 번 피펫팅하여 혼합하십시오. 40 마이크로 리터의 물에 밀리리터 JBNts 당 1 밀리그램의 5 마이크로 리터를 첨가하면 밀리리터 당 111 마이크로 그램의 용액이됩니다.
그런 다음 표지 된 TGF-B1, Matrilin-3 용액에 밀리리터 JBNts 당 1 밀리그램의 5 마이크로 리터를 첨가하고 반복적으로 피펫하여 화합물을 혼합합니다. 각 샘플 그룹을 검정 384 웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 플레이트를 다중 모드 마이크로플레이트 리더에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 488 및 555나노미터의 여기 파장에서 측정합니다.
생리 학적 조건 하에서, Matrilin-3의 제타 전위 스펙트럼은 등전점으로 인해 음전하를 띤다. TGF-B1을 마트릴린-3에 첨가한 후, TGF-B1 마트릴린-3 화합물의 제타 전위는 거의 중성 값으로 증가하였다. JBNm의 제타 전위는 세 그룹 중 가장 높았습니다.
UV 가시 흡수 스펙트럼은 JBNm의 층 내부 구조, 라이신 측쇄의 방향족 고리 및 JBNts가 각각 220 및 280 나노 미터에서 흡수 피크에 기여한 계층 적 층의 형성을 확인했습니다. TEM은 JBNts 및 JBNm의 형태를 특성화하는 데 사용되었습니다. 단백질과 결합한 후, JBNm의 두꺼운 다발이 스캐폴드 구조를 형성하는 것으로 관찰되었다.
형광 현미경은 층 별 구조의 존재를 확인하고 JBNm의 단면을 입증했습니다. 적색 형광 Matrilin-3을 표지 한 후 JBNt 번들을 감싸고 JBNm의 외부 층을 형성하고 녹색 형광 TGF-B1은 내부 층을 형성했습니다. 형광 공명 에너지 전달은 표지 된 TGF-B1 그룹의 경우 520 나노 미터, Matrilin-3 그룹의 경우 570 나노 미터에서 방출 피크를 표시했습니다.
HMSC의 부착 및 세포 증식에 대한 JBNm의 효과가 조사되었습니다. JBNm은 HMSC가 자체와 함께 클러스터링된 반면 JBNt에 부착된 세포는 더 적었습니다. JBNm에서 세포의 정렬과 세포의 크기는 JBNts가 세포 접착에 중요한 역할을하는 반면 단백질은 세포 접착의 친화력을 증가 시킨다는 것을 입증했습니다.
세포 배양 첫날 후, JBNm 및 TGF-B1 그룹은 다른 그룹에 비해 상당한 세포 증식을 보였다. 세포 구조 지속 기간이 3일 및 5일로 증가되었을 때, JBNm 및 TGF-B1 그룹은 훨씬 더 증가된 세포 증식을 입증하였다. JBNm을 형광 라벨링할 때 JBNts를 추가하기 전에 TGF-B1 및 Matrilin-3을 개별적으로 라벨링하고 혼합하여 레이어 구조를 적절하게 형성할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.
스캐폴드의 추가 평가는 치료 치료에 어떻게 효과적인지에 대한 이해를 제공할 수 있습니다. 보다 구체적으로, 고처리량 증식 분석은, 시험관내에서, 그리고 나중에 생체내에서 최적의 투여량을 결정할 수 있다. 이 새로운 NanoMatriX 생성을 통해 연구원들은 나노 물질 기반 주사 가능한 스캐폴드를 활용하여 연골을 재생할 수 있습니다.
이러한 폴리 모방 접근법은 향상된 안드로제네시스 및 카운터 부위 증식을 가능하게 한다.
