Este protocolo mostra como montamos e caracterizamos a camada por camada JBNm em um nível molecular. O JBNm encapsula o TGF-B1 e impede sua liberação no tecido circundante, promovendo assim a condrogênese localizada. A formação do JBNm é padronizada, permitindo que diferentes JBNms sejam formados para futuras aplicações.
A estrutura única camada por camada permite o encapsulamento do fator de crescimento, criando uma liberação localizada constante, o que evita a hipertrofia e sustenta o crescimento. O JBNm fornece um microambiente homeostático para a regeneração do tecido cartilaginoso, dentro de um local confinado, devido à sua injetabilidade, que pode ser usada para diferentes cenários, como fraturas ou cavidades de forma irregular. Para começar, adicione oito microlitros de um miligrama por mililitro de TGF-B1, suspenso em água a 32 microlitros de um miligrama por mililitro de Matrilin-3 suspenso em água.
Pipeta para garantir a mistura adequada dessas proteínas. Adicione 80 microlitros de um miligrama por mililitro. Nanotubos de base de Janus, ou JBNts suspensos em água, para a solução de TGF-B1, Matrilin-3.
Pipeta repetidamente para garantir a mistura adequada. Para o grupo JBNt, adicione cinco microlitros de um miligrama por mililitro, JBNts a 50 microlitros de água para fazer uma solução de 90,9 microgramas por mililitro. Para o grupo Matrilin-3, adicione 40 microlitros de 10 microgramas por mililitro de Matrilin-3 a 15 microlitros de água, para fazer uma solução de 7,3 microgramas por mililitro.
Para o grupo TGF-B1, adicione 10 microlitros de 10 microgramas por mililitro, de TGF-B1 a 45 microlitros de água, para fazer uma solução de 1,8 micrograma por mililitro. Para o grupo Janus Base Nano-Matrix ou JBNm, adicione 40 microlitros de 10 microgramas por mililitro, Matrilin-3 a 10 microlitros de 10 microgramas por mililitro de TGF-B1. Agite para garantir uma mistura adequada.
Em seguida, adicione cinco microlitros de um miligrama por mililitro JBNts à solução, repetidamente pipetando para misturar a amostra. Usando um espectrofotômetro, meça o espectro de absorção de cada grupo. Rotule o TGF-B1 usando um kit de rotulagem de proteínas, seguindo as instruções do fabricante.
Adicione 20 microlitros de 20 microgramas por mililitro, rotulados TGF-B1, a 25 microlitros de água, para fazer uma solução de teste de 8,9 microgramas por mililitro. Rotule o Matrilin-3 usando um kit de rotulagem separado. Adicione 20 microlitros de 80 microgramas por mililitro rotulado Matrilin-3 a 25 microlitros de água, para fazer uma solução de teste de 36 microgramas por mililitro.
Misture 20 microlitros de 80 microgramas por mililitro rotulado Matrilin-3 com 20 microlitros de 20 microgramas por mililitro rotulado TGF-B1 e cinco microlitros de água, resultando em um composto TGF-B1, Matrilin-3 rotulado. Pipetar a mistura várias vezes para misturar. Adicione cinco microlitros de um miligrama por mililitro JBNts a 40 microlitros de água, resultando em uma solução de 111 microgramas por mililitro.
Em seguida, adicione cinco microlitros de um miligrama por mililitro JBNts à solução de TGF-B1, Matrilin-3 rotulada e repetidamente pipeta para misturar o composto. Transfira cada grupo de amostras para o poço de uma placa preta de 384 poços. Carregue a placa em um leitor de microplacas multimodo e faça medições em comprimentos de onda de excitação de 488 e 555 nanômetros seguindo os protocolos do fabricante.
Em condições fisiológicas, o espectro potencial zeta da Matrilina-3 foi carregado negativamente devido ao seu ponto isoelétrico. Após a adição do TGF-B1 ao Matrilin-3, o potencial zeta do composto TGF-B1 Matrilin-3 aumentou para um valor quase neutro. O potencial zeta do JBNm foi o maior entre os três grupos.
Os espectros de absorção visível UV confirmaram a formação da estrutura interior camada por camada do JBNm, os anéis aromáticos das cadeias laterais de lisina e os JBNts contribuíram para os picos de absorção, a 220 e 280 nanômetros, respectivamente. O ETM foi utilizado para caracterizar a morfologia dos JBNts e JBNm. Após a combinação com proteínas, feixes espessos de JBNm foram observados formando uma estrutura de andaime.
A microscopia de fluorescência confirmou a presença da estrutura camada por camada e demonstrou a seção transversal do JBNm. Após a marcação, a fluorescente vermelha Matrilin-3 envolveu os feixes JBNt e formou a camada externa do JBNm, enquanto a fluorescente verde TGF-B1 formou uma camada interna. A transferência de energia de ressonância de fluorescência apresentou picos de emissão de 520 nanômetros para os grupos TGF-B1 marcados e 570 nanômetros para os grupos Matrilin-3.
O efeito do JBNm na adesão e proliferação celular do HMSC foi explorado. O JBNm mostrou HMSCs agrupados junto com ele mesmo, enquanto menos células aderiram ao JBNts. O alinhamento das células e o tamanho das células no JBNm demonstraram que o JBNts desempenhou um papel na adesão celular, enquanto as proteínas aumentaram a afinidade da adesão celular.
Após o primeiro dia de cultura celular, os grupos JBNm e TGF-B1 apresentaram proliferação celular significativa em comparação com os demais grupos. Quando a duração da estrutura celular foi aumentada para três e cinco dias, os grupos JBNm e TGF-B1 demonstraram ainda mais aumento da proliferação celular. Ao marcar fluorescentemente o JBNm, é importante que o TGF-B1 e o Matrilin-3 sejam rotulados individualmente e misturados antes de adicionar os JBNts, para permitir a formação adequada da estrutura camada por camada.
Uma avaliação mais aprofundada do andaime pode fornecer uma compreensão de como eles são eficazes em tratamentos terapêuticos. Mais especificamente, um ensaio de proliferação de alto rendimento pode determinar a dosagem ideal in vitro e, mais tarde, in vivo. Esta nova criação do NanoMatriX permite que os pesquisadores utilizem um andaime injetável à base de nanomateriais para regenerar a cartilagem.
Esta abordagem de polimimetização permite uma androgênese aprimorada e a proliferação do contra-local.
