Bu protokol, katmanı moleküler düzeyde JBNm katmanına göre nasıl birleştirdiğimizi ve karakterize ettiğimizi gösterir. JBNm, TGF-B1'i kapsüller ve çevre dokuda salınmasını önler, böylece lokalize kondrogenezi teşvik eder. JBNm'nin oluşumu standartlaştırılmıştır ve gelecekteki uygulamalar için farklı JBNm'lerin oluşturulmasına izin verilmiştir.
Benzersiz katman katman yapısı, büyüme faktörü kapsüllemesine izin verir, hipertrofiyi önleyen ve büyümeyi sürdüren sabit bir lokalize salınım yaratır. JBNm, düzensiz şekilli kırıklar veya boşluklar gibi farklı senaryolar için kullanılabilen enjekte edilebilirliği nedeniyle, sınırlı bir yerde, kıkırdak dokusunun yenilenmesi için homeostatik bir mikro ortam sağlar. Başlamak için, suda asılı mililitre başına bir miligramlık sekiz mikrolitre TGF-B1'e, suda asılı mililitre başına bir miligramın 32 mikrolitresine Matrilin-3 ekleyin.
Bu proteinlerin uygun şekilde karıştırılmasını sağlamak için pipet. Mililitre başına 80 mikrolitre bir miligram ekleyin. Janus Base Nanotüpleri veya suda asılı JBNt'ler, TGF-B1, Matrilin-3 çözeltisine.
Doğru karıştırmayı sağlamak için tekrar tekrar pipet. JBNt grubu için, mililitre başına 90.9 mikrogramlık bir çözelti yapmak için 50 mikrolitre suya beş mikrolitre, 50 mikrolitre suya JBNts ekleyin. Matrilin-3 grubu için, mililitre başına 7.3 mikrogramlık bir çözelti yapmak için mililitre başına 40 mikrolitre 10 mikrogram Matrilin-3 ila 15 mikrolitre su ekleyin.
TGF-B1 grubu için, mililitre başına 1.8 mikrogramlık bir çözelti yapmak için mililitre başına 10 mikrogram, TGF-B1'den 45 mikrolitre suya 10 mikrolitre ekleyin. Janus Base Nano-Matrix veya JBNm grubu için, mililitre başına 40 mikrolitre 10 mikrogram, Matrilin-3 ila 10 mikrolitre 10 mikrolitre başına mililitre TGF-B1 ekleyin. Doğru karıştırmayı sağlamak için çalkalayın.
Daha sonra, çözeltiye mililitre JBNts başına bir miligramlık beş mikrolitre ekleyin ve numuneyi karıştırmak için tekrar tekrar pipetleyin. Bir spektrofotometre kullanarak, her grubun absorpsiyon spektrumunu ölçün. TGF-B1'i, üreticinin talimatlarını izleyerek bir protein etiketleme kiti kullanarak etiketleyin.
Mililitre başına 8,9 mikrogram test çözeltisi yapmak için 25 mikrolitre suya TGF-B1 etiketli 20 mikrolitre 20 mikrogram ekleyin. Matrilin-3'ü ayrı bir etiketleme kiti kullanarak etiketleyin. Mililitre başına 36 mikrogram test çözeltisi yapmak için Matrilin-3 etiketli mililitre başına 20 mikrolitre 80 mikrogram ila 25 mikrolitre su ekleyin.
Matrilin-3 etiketli mililitre başına 20 mikrolitre 80 mikrogram ile TGF-B1 etiketli mililitre başına 20 mikrolitre 20 mikrogram ve beş mikrolitre su karıştırın, böylece etiketli TGF-B1, Matrilin-3 bileşiği elde edin. Karıştırmak için karışımı birkaç kez pipetleyin. 40 mikrolitre suya mililitre JBNts başına beş mikrolitre bir miligram ekleyin, bu da mililitre başına 111 mikrogram çözelti ile sonuçlanır.
Ardından, etiketli TGF-B1, Matrilin-3 çözeltisine mililitre JBNt'ler başına bir miligramlık beş mikrolitre ekleyin ve bileşiği karıştırmak için tekrar tekrar pipet ekleyin. Her numune grubunu siyah bir 384 kuyu plakasının kuyusuna aktarın. Plakayı çok modlu bir mikro plaka okuyucuya yükleyin ve üreticinin protokollerini izleyerek 488 ve 555 nanometre uyarma dalga boylarında ölçümler yapın.
Fizyolojik koşullar altında, Matrilin-3'ün zeta potansiyel spektrumu, izoelektrik noktası nedeniyle negatif yüklüydü. TGF-B1'in Matrilin-3'e eklenmesinden sonra, TGF-B1 Matrilin-3 bileşiğinin zeta potansiyeli neredeyse nötr bir değere yükseldi. JBNm'nin zeta potansiyeli üç grup arasında en yüksek seviyedeydi.
UV görünür absorpsiyon spektrumları, JBNm'nin katman iç yapısına, lizin yan zincirlerinin aromatik halkalarına ve JBNt'lerin sırasıyla 220 ve 280 nanometrede absorpsiyon zirvelerine katkıda bulunarak hiyerarşik tabakanın oluşumunu doğruladı. JBNts ve JBNm'lerin morfolojisini karakterize etmek için TEM kullanıldı. Proteinlerle birleştikten sonra, kalın JBNm demetlerinin bir iskele yapısı oluşturduğu gözlendi.
Floresan mikroskobu, katmanın varlığını katman yapısına göre doğruladı ve JBNm'nin enine kesitini gösterdi. Kırmızı floresan Matrilin-3 etiketlendikten sonra JBNt demetlerini sardı ve JBNm'nin dış katmanını oluştururken, yeşil floresan TGF-B1 bir iç tabaka oluşturdu. Floresan rezonans enerji transferi, etiketli TGF-B1 grupları için 520 nanometrede ve Matrilin-3 grupları için 570 nanometrede emisyon zirveleri gösterdi.
JBNm'nin HMSC'nin adezyonu ve hücre proliferasyonu üzerindeki etkisi araştırıldı. JBNm, HMSC'lerin kendisiyle birlikte kümelendiğini gösterirken, JBNt'lere daha az hücre yapıştı. Hücrelerin hizalanması ve JBNm'deki hücrelerin büyüklüğü, JBNt'lerin hücre yapışmasında rol oynadığını, proteinlerin ise hücre yapışmasının afinitesini arttırdığını göstermiştir.
Hücre kültürünün ilk gününden sonra, JBNm ve TGF-B1 grupları diğer gruplara kıyasla önemli hücre proliferasyonu gösterdi. Hücre yapısı süresi üç ve beş güne çıkarıldığında, JBNm ve TGF-B1 grupları hücre proliferasyonunun daha da arttığını gösterdi. JBNm'yi floresan olarak etiketlerken, katmanın katman yapısına göre düzgün bir şekilde oluşturulmasına izin vermek için TGF-B1 ve Matrilin-3'ün JBNt'leri eklemeden önce ayrı ayrı etiketlenmesi ve karıştırılması önemlidir.
İskelenin daha fazla değerlendirilmesi, terapötik tedavilerde nasıl etkili olduklarının anlaşılmasını sağlayabilir. Daha spesifik olarak, yüksek verimli bir proliferasyon testi, in vitro ve daha sonra in vivo optimal dozu belirleyebilir. Bu yeni NanoMatriX yaratımı, araştırmacıların kıkırdakları yenilemek için nano malzeme bazlı enjekte edilebilir bir iskele kullanmalarını sağlar.
Bu poli taklit yaklaşımı, androgenezin artmasına ve karşı bölge proliferasyonuna izin verir.
