Questo protocollo mostra come abbiamo assemblato e caratterizzato strato per strato JBNm a livello molecolare. JBNm incapsula TGF-B1 e ne impedisce il rilascio nel tessuto circostante, promuovendo così la condrogenesi localizzata. La formazione del JBNm è standardizzata, consentendo la formazione di diversi JBNm per applicazioni future.
L'esclusiva struttura strato per strato consente l'incapsulamento del fattore di crescita, creando un rilascio localizzato costante, che evita l'ipertrofia e sostiene la crescita. JBNm fornisce un microambiente omeostatico per la rigenerazione del tessuto cartilagineo, all'interno di un luogo confinato, grazie alla sua iniettabilità, che può essere utilizzata per diversi scenari, come fratture o cavità di forma irregolare. Per iniziare, aggiungere otto microlitri di un milligrammo per millilitro TGF-B1, sospeso in acqua a 32 microlitri di un milligrammo per millilitro Matrilin-3 sospeso in acqua.
Pipetta per garantire una corretta miscelazione di queste proteine. Aggiungere 80 microlitri di un milligrammo per millilitro. Janus Base Nanotubes, o JBNts sospesi in acqua, alla soluzione TGF-B1, Matrilin-3.
Pipettare ripetutamente per garantire una corretta miscelazione. Per il gruppo JBNt, aggiungere cinque microlitri di un milligrammo per millilitro, JBNts a 50 microlitri di acqua per ottenere una soluzione da 90,9 microgrammi per millilitro. Per il gruppo Matrilin-3, aggiungere 40 microlitri di 10 microgrammi per millilitro di Matrilin-3 a 15 microlitri di acqua, per ottenere una soluzione da 7,3 microgrammi per millilitro.
Per il gruppo TGF-B1, aggiungere 10 microlitri di 10 microgrammi per millilitro, di TGF-B1 a 45 microlitri di acqua, per ottenere una soluzione da 1,8 microgrammi per millilitro. Per il gruppo Janus Base Nano-Matrix o JBNm, aggiungere 40 microlitri di 10 microgrammi per millilitro, Matrilin-3 a 10 microlitri di 10 microgrammi per millilitro TGF-B1. Agitare per garantire una corretta miscelazione.
Quindi, aggiungere cinque microlitri di un milligrammo per millilitro di JBNts alla soluzione, pipettando ripetutamente per miscelare il campione. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare lo spettro di assorbimento di ciascun gruppo. Etichettare il TGF-B1 utilizzando un kit di etichettatura proteica, seguendo le istruzioni del produttore.
Aggiungere 20 microlitri di 20 microgrammi per millilitro, etichettati TGF-B1, a 25 microlitri di acqua, per ottenere una soluzione di prova da 8,9 microgrammi per millilitro. Etichettare il Matrilin-3 utilizzando un kit di etichettatura separato. Aggiungere 20 microlitri di 80 microgrammi per millilitro etichettato Matrilin-3 a 25 microlitri di acqua, per ottenere una soluzione di prova da 36 microgrammi per millilitro.
Mescolare 20 microlitri di 80 microgrammi per millilitro etichettato Matrilin-3 con 20 microlitri di 20 microgrammi per millilitro etichettato TGF-B1 e cinque microlitri di acqua, ottenendo un TGF-B1 marcato, composto Matrilin-3. Pipettare la miscela più volte per mescolare. Aggiungere cinque microlitri di un milligrammo per millilitro di JBNts a 40 microlitri di acqua, ottenendo una soluzione di 111 microgrammi per millilitro.
Quindi aggiungere cinque microlitri di un milligrammo per millilitro di JBNts alla soluzione etichettata TGF-B1, Matrilin-3 e pipettare ripetutamente per miscelare il composto. Trasferire ciascun gruppo di campioni nel pozzetto di una piastra nera da 384 pozzetti. Caricare la piastra in un lettore di micropiastre multimodale ed effettuare misurazioni a lunghezze d'onda di eccitazione di 488 e 555 nanometri seguendo i protocolli del produttore.
In condizioni fisiologiche, lo spettro del potenziale zeta di Matrilin-3 era caricato negativamente a causa del suo punto isoelettrico. Dopo l'aggiunta del TGF-B1 al Matrilin-3, il potenziale zeta del composto Matrilin-3 TGF-B1 è aumentato ad un valore quasi neutro. Il potenziale zeta di JBNm era il più alto tra i tre gruppi.
Gli spettri di assorbimento visibile UV hanno confermato la formazione della struttura interna gerarchica strato per strato del JBNm, gli anelli aromatici delle catene laterali della lisina e i JBNt hanno contribuito ai picchi di assorbimento, rispettivamente a 220 e 280 nanometri. TEM è stato utilizzato per caratterizzare la morfologia dei JBNts e JBNm. Dopo la combinazione con le proteine, sono stati osservati spessi fasci di JBNm che formano una struttura di impalcatura.
La microscopia a fluorescenza ha confermato la presenza della struttura strato per strato e ha dimostrato la sezione trasversale del JBNm. Dopo aver etichettato il fluorescente rosso Matrilin-3 avvolgeva i fasci JBNt e formava lo strato esterno del JBNm, mentre il TGF-B1 fluorescente verde formava uno strato interno. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza ha mostrato picchi di emissione a 520 nanometri per i gruppi TGF-B1 marcati e 570 nanometri per i gruppi Matrilin-3.
È stato esplorato l'effetto di JBNm sull'adesione e sulla proliferazione cellulare di HMSC. Il JBNm ha mostrato HMSC raggruppati insieme a se stesso, mentre meno celle hanno aderito a JBNts. L'allineamento delle cellule e la dimensione delle cellule sul JBNm hanno dimostrato che JBNts ha svolto un ruolo nell'adesione cellulare, mentre le proteine hanno aumentato l'affinità dell'adesione cellulare.
Dopo il primo giorno di coltura cellulare, i gruppi JBNm e TGF-B1 hanno mostrato una proliferazione cellulare significativa rispetto agli altri gruppi. Quando la durata della struttura cellulare è stata aumentata a tre e cinque giorni, i gruppi JBNm e TGF-B1 hanno dimostrato una proliferazione cellulare ancora maggiore. Quando si etichettano in modo fluorescente il JBNm, è importante che TGF-B1 e Matrilin-3 siano etichettati individualmente e miscelati prima di aggiungere i JBNt, per consentire una corretta formazione della struttura strato per strato.
Un'ulteriore valutazione dello scaffold può fornire una comprensione di come sono efficaci nei trattamenti terapeutici. Più specificamente, un test di proliferazione ad alto rendimento, può determinare il dosaggio ottimale in vitro e successivamente in vivo. Questa nuova creazione di NanoMatriX consente ai ricercatori di utilizzare un'impalcatura iniettabile a base di nanomateriali per rigenerare la cartilagine.
Questo approccio di poli-imitazione consente una maggiore androgenesi e la proliferazione del sito contatore.
