我们描述了将GEM衍生的胶质母细胞瘤细胞颅内注射到免疫功能正常的小鼠大脑中的最佳技术，从而产生概括了人胶质母细胞瘤关键特征的肿瘤。这种用于原位注射GEM衍生的TRP细胞的技术对起源于皮层的肿瘤产生了高度可重复，可扩展和一致的结果，同时保持了GEM肿瘤的侵袭性。小鼠胶质母细胞瘤脑肿瘤表现出侵袭性生长并侵入周围的脑实质。

因此，它可用于评估可能抑制患者肿瘤浸润和迁移的治疗方法。该协议可以针对其他脑肿瘤模型，病毒，治疗方法进行定制，或者通过调整立体定位坐标来适应注射到不同的大脑区域。演示该程序的将是我实验室的研究助理Devon Atkinson。

首先，将表面保护器放置在立体定位设备和工作表面上。将乙烯基管从麻醉机连接到立体定位装置的气体麻醉平台的内端口，并将另一根管连接到其出口。将数字显示器连接到电源和设备。

接下来，将微型泵控制器连接到电源后，将微型泵连接到设备的机械臂上。将微型泵设置为每秒 5.6 纳升。将鼠标加热垫连接到温度控制器和电源。

通过避免气泡，将带有甲基甲基纤维素细胞混合物的 30 号精密注射器背载。插入柱塞后，连接针头，然后按下柱塞，直到加载的细胞混合物通过针头下降。用70%酒精制备垫清洁针头。

将精密注射器连接到微型泵后，在放置鼠标之前将机械臂旋转远离载物台，以防止注射器针头移位。将麻醉小鼠转移到立体定位仪器上，并通过将上牙放在鼻锥支架上将其固定在鼻锥上。用旋钮收紧鼻锥后，捏住脚趾以检查反射以确保适当的麻醉。

然后插入耳杆并拧紧旋钮以固定头部。在麻醉条件下涂抹眼膏润滑眼睛。皮下注射丁丙诺啡SR镇痛药，并放置直肠小鼠探针监测内部温度。

使用向外圆圈对手术区域进行消毒，在手术擦洗和乙醇之间交替使用三次。用镊子拉紧绷的皮肤，然后用手术刀刀片在眼睛之间做一个大约 1 厘米长的切口。对于细胞注射，将注射器连接到鼠标的机械臂返回。

拧紧旋钮后，使用水平面上的X和Y旋钮移动注射器并将其安装在前膛上。使用 Z 旋钮降低指针以确认前膛位置，并将数字读数控制台设置为零。然后按照手稿中的描述，使用X和Y旋钮以及相应的数字读数将针移动到所需位置，并使用Z旋钮将针移动到颅骨表面。

使用带有25号针头的1毫升注射器刺穿颅骨上的孔。小心地将机械臂旋转到一边，同时将针头的斜面朝向 30 号精密注射器。一旦装有精密注射器针头的机械臂定位在孔上方，将针尖与孔对齐，并使用Z旋钮将针头降低到大脑的硬脑膜中。

将数字读数控制台设置为零后，用 Z 旋钮将指针降低 1 毫米，然后等待一分钟。一旦达到2毫米的深度，停止微型泵，并确保泵在注入2微升细胞悬液时停止。要从头骨上取下针头，请将其抬高一毫米，然后等待一分钟。

对于伤口闭合，使用棉头涂抹器的木端，取一块骨蜡并将其塑造成圆锥体。将蜡放入颅骨的开口后，将其推入孔中。使用珠子灭菌的镊子融化头骨上剩余的蜡。

一旦它变得光滑，在切口中加入两滴麻醉剂布比卡因溶液，并使用镊子将皮肤边缘拉在一起。拉紧皮肤后，使用一个或两个伤口夹，关闭皮肤，将鼠标放在无气流区域的加热垫上的干净恢复笼中，并仔细观察小鼠。每周MRI扫描显示大脑内的肿瘤负荷增加，肿瘤体积测量。

MRI肿瘤体积测量显示即使在放射治疗后也缺乏肿瘤生长抑制，并且治疗小鼠的存活率没有增加。同系模型中的GBM肿瘤似乎积极生长，并通过终末终点突破颅骨。如果在细胞植入后成像上观察到颅外生长，则表明注射过程中细胞泄漏，并且在取出注射针时应更加小心。

原位 TRP GBM 肿瘤的组织病理学检查证实存在 4 级星形细胞瘤，包括重现肿瘤的独特特征，例如假栅栏和坏死。在bregma处设置零点时要精确，以确保正确的细胞注射坐标。降低和抬高大脑中的针头必须缓慢，以防止创伤和回流。

注射肿瘤细胞后，可以使用每周MRI扫描来确定开始治疗前的基线肿瘤大小，并可视化大脑内肿瘤负荷的变化。