Descriviamo la tecnica ottimale per l'iniezione intracranica di cellule di glioblastoma derivate da GEM in un cervello di topo immunocompetente con conseguenti tumori che ricapitolano le caratteristiche chiave del glioblastoma umano. Questa tecnica per l'iniezione ortotopica di cellule TRP derivate da GEM produce risultati altamente riproducibili, scalabili e coerenti per i tumori che hanno origine nella corteccia, pur mantenendo l'invasività dei tumori GEM. I tumori cerebrali del glioblastoma di topo mostrano una crescita aggressiva e invadono il parenchima cerebrale circostante.
Pertanto, può essere utilizzato per valutare le terapie che possono sopprimere l'infiltrazione e la migrazione del tumore nei pazienti. Questo protocollo può essere personalizzato per altri modelli di tumore cerebrale, virus, terapie o adattato per l'iniezione in diverse regioni del cervello con le regolazioni delle coordinate stereotassiche. A dimostrare la procedura sarà Devon Atkinson, un ricercatore associato del mio laboratorio.
Per iniziare, posizionare le protezioni superficiali sotto l'apparato stereotassico e sul piano di lavoro. Collegare il tubo in vinile dalla macchina per anestesia all'in-port della piattaforma di anestesia gassosa dell'apparato stereotassico e un altro tubo al suo out-port. Collegare il display digitale a una fonte di alimentazione e all'apparecchio.
Quindi, collegare la micropompa al braccio manipolatore dell'apparecchio dopo aver collegato il controller della micropompa alla fonte di alimentazione. Impostare la micropompa su 5,6 nanolitri al secondo. Collegare il termoforo del mouse al regolatore di temperatura e a una fonte di alimentazione.
Caricare una siringa di precisione calibro 30 con una miscela di cellule di metilcellulosa metilica evitando bolle. Dopo aver inserito lo stantuffo, collegare l'ago e premere lo stantuffo fino a quando la miscela di cellule caricata cade attraverso l'ago. Pulire l'ago con un tampone per la preparazione di alcol al 70%.
Una volta che la siringa di precisione è collegata alla micropompa, ruotare il braccio del manipolatore lontano dal palco prima di posizionare il mouse per evitare lo spostamento dell'ago della siringa. Trasferire il mouse anestetizzato sullo strumento stereotassico e fissarlo al cono del naso posizionando i denti superiori sul supporto del cono nasale. Dopo aver stretto il cono del naso con una manopola, pizzicare un dito del piede per controllare i riflessi per garantire una corretta anestesia.
Quindi inserire le barre auricolari e stringere la manopola per fissare la testa. Applicare unguento oculare per lubrificare gli occhi in condizioni anestetizzate. Iniettare buprenorfina SR analgesico per via sottocutanea e posizionare una sonda topo rettale per monitorare la temperatura interna.
Sterilizzare il campo chirurgico utilizzando cerchi verso l'esterno, alternando uno scrub chirurgico e l'etanolo tre volte. Tirare la pelle tesa con una pinza e utilizzare una lama di bisturi per fare un'incisione lunga circa 1 centimetro tra gli occhi. Per l'iniezione cellulare, riportare il braccio manipolatore con la siringa collegata al mouse.
Dopo aver serrato le manopole, spostare la siringa usando le manopole X e Y sul piano orizzontale e montarla sopra il bregma. Abbassare l'ago, utilizzando la manopola Z, per confermare la posizione del bregma e impostare la console di lettura digitale su zero. Quindi spostare l'ago nella posizione desiderata, come descritto nel manoscritto, utilizzando le manopole X e Y e la corrispondente lettura digitale, e utilizzare la manopola Z per spostare l'ago sulla superficie del cranio.
Forare un buco nel cranio usando una siringa da 1 millilitro con un ago calibro 25 attaccato. Ruotare con attenzione il braccio del manipolatore verso il lato, posizionando la smussatura dell'ago verso la siringa di precisione calibro 30. Una volta che il braccio manipolatore con l'ago della siringa di precisione caricato è posizionato sopra il foro, allineare la punta dell'ago con il foro e utilizzare la manopola Z per abbassare l'ago nella dura del cervello.
Dopo aver impostato la console di lettura digitale a zero, abbassare l'ago di 1 millimetro con la manopola Z e attendere un minuto. Una volta raggiunta la profondità di 2 millimetri, arrestare la micropompa e assicurarsi che la pompa si fermi quando sono stati iniettati 2 microlitri di sospensione cellulare. Per rimuovere l'ago dal cranio, sollevarlo di un millimetro e attendere un minuto.
Per la chiusura della ferita, utilizzando l'estremità in legno di un applicatore con punta di cotone, prendere un pezzo di cera ossea e modellarlo in un cono. Dopo aver inserito la cera nell'apertura del cranio, spingerla nel foro. Utilizzare la pinza sterilizzata a perline per sciogliere la cera rimanente sul cranio.
Una volta che diventa liscio, aggiungere due gocce di soluzione anestetica bupivacaina nell'incisione e tirare i bordi della pelle insieme, usando una pinza. Dopo aver tirato la pelle tesa, usando una o due clip per ferite, chiudere la pelle, posizionare il topo in una gabbia di recupero pulita su una piastra riscaldante in un'area priva di correnti d'aria e osservare attentamente il topo. Le scansioni MRI settimanali hanno mostrato un aumento del carico tumorale all'interno del cervello e misurazioni del volume del tumore.
La misurazione del volume tumorale MRI ha rivelato una mancanza di soppressione della crescita tumorale anche dopo il trattamento con radiazioni e la sopravvivenza dei topi trattati non è aumentata. I tumori GBM nei modelli singeneici sembravano essere cresciuti in modo aggressivo e violare il cranio dall'endpoint terminale. Se si osserva una crescita extracranica all'imaging dopo l'impianto cellulare, ciò indica una perdita di cellule durante il processo di iniezione e si deve prestare maggiore attenzione durante il ritiro dell'ago per iniezione.
L'istopatologia dei tumori ortotopici TRP GBM ha confermato la presenza di astrocitoma di grado 4, compresa la ricapitolazione delle caratteristiche distintive nei tumori come la pseudopalizzata e la necrosi. Essere precisi quando si imposta il punto zero al bregma per garantire la corretta iniezione cellulare. Abbassare e alzare l'ago nel cervello deve essere lento per prevenire traumi e riflusso.
Dopo l'iniezione di cellule tumorali, le scansioni MRI settimanali possono essere utilizzate per determinare le dimensioni del tumore al basale prima di iniziare il trattamento e per visualizzare il cambiamento del carico tumorale all'interno del cervello.
