该协议描述了一种用于红色肿瘤细胞计数的方法，以及临床CTC分离的方法。首先，在细胞培养瓶中以1毫米DMEM中的10至5倍培养肿瘤细胞MCF-7，MDA-MB-231和HeLa，补充10%胎牛血清和1%青霉素 - 链霉素。将细胞在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育。

当细胞系作为贴壁单层生长至95%汇合时，将它们从含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中分离两分钟。通过加入三微升钙黄绿素AM对肿瘤细胞进行染色，并将培养皿放入培养箱中30分钟。在孵育结束时，用胰蛋白酶消化所有细胞。

用细胞计数室计数PBS中的培养肿瘤细胞，并稀释至每1毫升PBS获得100个肿瘤细胞。接下来，使用带有注射泵的注射器以不同的流速将稀释的细胞悬液引入微流控芯片中。获得各种流速的捕获效率，并确定最佳流速。

计算芯片上捕获并从出口流出的肿瘤细胞的数量。使用给定的公式计算捕获效率。重复该过程以获得不同数量的肿瘤细胞的捕获效率，从10到100。

测试和验证微流控芯片的稀有数量肿瘤细胞。使用由微量移液器拉拔器制成的空心针将这 10 种样品悬浮液注入微流控芯片中，以吸出稀释的肿瘤细胞。检测并枚举每个样品在芯片上捕获后的肿瘤细胞数量。

接下来，用钙黄绿素AM染色肿瘤细胞，并在5微升PBS中计数100个肿瘤细胞。将这些细胞加标到一毫升完整的正常血液样本中。将这些细胞引入芯片中，并用绿色免疫荧光枚举芯片上捕获的肿瘤细胞数量。

如上所述进行体内计数，并计算捕获后的捕获效率。枚举 1 到 10 个肿瘤细胞而不染色。将这些细胞加入一毫升完整的正常血液中。

将这些样品引入微流控芯片中，并捕获肿瘤细胞。将三到五微升的荧光染料加入20到30微升的PBS中，并用注射器将该溶液引入芯片上。用蓝色和绿色免疫荧光枚举芯片上捕获的肿瘤细胞数量，以确定捕获效率。

接下来，用100微升4%3-巯基丙基三甲氧基硅烷和乙醇在室温下修饰芯片表面45分钟，以亲和力捕获抗上皮细胞粘附分子。在孵育结束时，用乙醇洗涤芯片三次。然后加入100微升偶联剂GMBS，并使其相互作用30分钟。

在孵育结束时，使用注射器用一毫升PBS洗涤芯片三次。在室温下用30至40微升每毫升10微克的中性粒蛋白处理芯片30分钟，导致细胞固定在GMBS上，然后用PBS冲洗以去除多余的亲和素。用三微升抗生物素化上皮细胞粘附分子抗体修饰芯片，孵育过夜。

所有肿瘤细胞都被捕获在波芯片阵列周围，没有任何细胞丢失，表明微流控芯片的高捕获效率。此处显示了用Hoechst和钙黄绿素AM染色的肿瘤细胞。此处显示了使用小椭圆微过滤器捕获的胃癌患者的CTC。

此外，还显示了使用梯形微滤光片捕获的结直肠癌患者的CTC，并发出蓝色和绿色荧光。观察到使用大椭圆微过滤器捕获的肿瘤细胞的高捕获效率和活力。在微流控芯片上捕获的结直肠CTC的临床免疫荧光分析将CTC识别为DAPI阳性，CK阳性，CD45阴性，WBC为DAPI阳性，CK阴性，CD45阳性。

这里显示了捕获后在大椭圆芯片上培养的结直肠肿瘤细胞，以及在大椭圆微过滤器上捕获的结直肠肿瘤细胞。这种用适配体修饰的方法提供了一种富集CTC分离的新方法。