このプロトコルは、赤色腫瘍細胞列挙、および臨床CTC単離のための方法を記載した。はじめに、腫瘍細胞MCF-7、MDA-MB-231、およびHeLaを細胞培養フラスコ中で10〜5回、1ミリメートルのDMEMで培養し、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートします。
細胞株が接着性単層として95%コンフルエントに成長したら、0.25%トリプシン溶液で培養皿から2分間剥離します。3マイクロリットルのカルセインAMを加えて腫瘍細胞を染色し、皿をインキュベーターに30分間入れます。インキュベーションの終わりに、トリプシンですべての細胞を消化します。
細胞計数チャンバーを用いてPBS中の培養腫瘍細胞を計数し、PBS1ミリリットル当たり100個の腫瘍細胞が得られるまで希釈する。次に、希釈した細胞懸濁液を、シリンジポンプを備えたシリンジを用いて、様々な流速でマイクロ流体チップに導入する。さまざまな流量の捕捉効率を取得し、最適な流量を決定します。
チップ上に捕捉され、出口から流出した腫瘍細胞の数を数えます。指定された式を使用してキャプチャ効率を計算します。この手順を繰り返して、10から100までの異なる数の腫瘍細胞の捕捉効率を得る。
マイクロ流体チップの希少な数の腫瘍細胞をテストおよび検証します。マイクロピペットプラーで作られた中空針を使用して、これらの10サンプル懸濁液をマイクロ流体チップに注入し、希釈された腫瘍細胞を吸引します。チップ上で捕捉した後の各サンプルの腫瘍細胞の数を検出して列挙します。
次に、腫瘍細胞をカルセインAMで染色し、5マイクロリットルのPBS中の100個の腫瘍細胞を列挙します。これらの細胞を1ミリリットルの正常な血液サンプル全体にスパイクします。これらの細胞をチップに導入し、緑色の免疫蛍光でチップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を列挙する。
記載したように生体内列挙を行い、捕捉後の捕捉効率を算出する。染色せずに1〜10個の腫瘍細胞を列挙します。これらの細胞を1ミリリットルの正常な血液全体にスパイクします。
これらのサンプルをマイクロ流体チップに導入し、腫瘍細胞を捕捉します。20〜30マイクロリットルのPBSに3〜5マイクロリットルの蛍光色素を加え、この溶液をシリンジでチップに導入します。青と緑の免疫蛍光でチップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を列挙し、捕捉効率を決定します。
次に、チップの表面を100マイクロリットルの4%3-メルカプトプロピルトリメトキシシランとエタノールで室温で45分間修飾し、抗上皮細胞接着分子の親和性ベースの捕捉を行います。インキュベーションの終わりに、チップをエタノールで3回洗浄する。次に、100マイクロリットルのカップリング剤GMBSを追加し、30分間相互作用させます。
インキュベーションの終わりに、注射器を使用してチップを1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。チップを30〜40マイクロリットルの1ミリリットルあたり10マイクログラムのニュートラアビジンで室温で30分間処理し、細胞をGMBSに固定化してから、PBSで洗い流して余分なアビジンを除去します。3マイクロリットルの抗ビオチン化上皮細胞接着分子抗体でチップを修飾し、一晩インキュベートします。
すべての腫瘍細胞は、細胞が欠落することなくウェーブチップのアレイの周囲に捕捉され、マイクロ流体チップの高い捕捉効率を示しています。ヘキストおよびカルセインAMで染色された腫瘍細胞をここに示す。小さな楕円マイクロフィルターを使用してキャプチャされた胃がん患者のCTCがここに示されています。
また、台形のマイクロフィルターを使用してキャプチャされ、青色と緑色の両方の蛍光を発する結腸直腸癌患者のCTCが示されています。大きな楕円マイクロフィルターを使用して捕捉された腫瘍細胞について、高い捕捉効率と生存率が観察されました。マイクロ流体チップ上に捕捉された結腸直腸CTCの臨床免疫蛍光分析は、CTCをDAPI陽性、CK陽性、CD45陰性として認識し、WBCをDAPI陽性、CK陰性、CD45陽性として認識した。
ここでは、大きな楕円チップ上で捕捉した後に培養した大腸腫瘍細胞と、大きな楕円マイクロフィルター上で捕捉した大腸腫瘍細胞を示します。アプタマーを用いたこの修飾方法は、CTC単離を強化するための新しいアプローチを提供します。
