Dieses Protokoll beschrieb eine Methode zur Zählung roter Tumorzellen und zur klinischen CTC-Isolierung. Zu Beginn werden die Tumorzellen MCF-7, MDA-MB-231 und HeLa in einem Zellkulturkolben einmal 10 bis 15 in einem Millimeter DMEM kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Wenn die Zelllinien als adhärente Monoschichten bis zu 95 % Konfluenz wachsen, lösen Sie sie zwei Minuten lang mit 0,25 %iger Trypsinlösung von der Kulturschale. Färben Sie die Tumorzellen durch Zugabe von drei Mikrolitern Calcein AM und stellen Sie die Schale für 30 Minuten in den Inkubator. Am Ende der Inkubation werden alle Zellen mit Trypsin verdaut.
Zählen Sie die Kulturtumorzellen in PBS mit einer Zellzählkammer und verdünnen Sie sie, bis 100 Tumorzellen pro einem Milliliter PBS erhalten sind. Als nächstes wird die verdünnte Zellsuspension mit einer Spritze mit einer Spritzenpumpe mit unterschiedlichen Durchflussraten in den Mikrofluidik-Chip eingeführt. Ermitteln Sie die Abscheideeffizienz für die verschiedenen Durchflussraten und bestimmen Sie die optimale Durchflussrate.
Zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen, die auf dem Chip erfasst wurden und aus dem Auslass herausfließen. Berechnen Sie die Abscheideeffizienz mit der angegebenen Formel. Wiederholen Sie den Vorgang, um die Einfangeffizienz für eine unterschiedliche Anzahl von Tumorzellen von 10 bis 100 zu erhalten.
Testen und validieren Sie den Mikrofluidik-Chip auf eine seltene Anzahl von Tumorzellen. Injizieren Sie diese 10 Probensuspensionen mit einer Hohlnadel aus einem Mikropipettenzieher in die Mikrofluidik-Chips, um verdünnte Tumorzellen abzusaugen. Erkennen und zählen Sie die Anzahl der Tumorzellen für jede Probe nach ihrer Erfassung auf dem Chip.
Als nächstes färben Sie die Tumorzellen mit Calcein AM und zählen Sie 100 Tumorzellen in fünf Mikrolitern PBS. Spießen Sie diese Zellen in eine Milliliter volle, normale Blutprobe. Führen Sie diese Zellen in den Chip ein und zählen Sie die Anzahl der auf dem Chip erfassten Tumorzellen mit grüner Immunfluoreszenz.
Führen Sie die In-vivo-Enumeration wie beschrieben durch, und berechnen Sie die Abscheideeffizienz nach der Erfassung. Zählen Sie ein bis 10 Tumorzellen ohne Färbung. Versetzen Sie diese Zellen in einen Milliliter volles, normales Blut.
Führen Sie diese Proben in den Mikrofluidik-Chip ein und fangen Sie die Tumorzellen ein. Geben Sie drei bis fünf Mikroliter Fluoreszenzfarbstoff in 20 bis 30 Mikroliter PBS und geben Sie diese Lösung mit einer Spritze auf den Chip. Zählen Sie die Anzahl der auf dem Chip erfassten Tumorzellen mit blauer und grüner Immunfluoreszenz, um die Abscheideeffizienz zu bestimmen.
Als nächstes wird die Oberfläche des Chips mit 100 Mikrolitern 4%3-Mercaptopropyltrimethoxysilan und Ethanol bei Raumtemperatur für 45 Minuten modifiziert, um das affinitätsbasierte Einfangen des Antiepithelzelladhäsionsmoleküls zu ermöglichen. Waschen Sie den Chip am Ende der Inkubation dreimal mit Ethanol. Dann 100 Mikroliter des Haftvermittlers GMBS zugeben und 30 Minuten einwirken lassen.
Waschen Sie den Chip am Ende der Inkubation mit einer Spritze dreimal mit einem Milliliter PBS. Behandeln Sie den Chip 30 Minuten lang mit 30 bis 40 Mikrolitern 10 Mikrogramm pro Milliliter Neutravidin bei Raumtemperatur, was zu einer Immobilisierung der Zellen auf dem GMBS führt, und spülen Sie dann mit PBS, um überschüssiges Avidin zu entfernen. Modifizieren Sie den Chip mit drei Mikrolitern antibiotinyliertem Epithelzelladhäsionsmolekül-Antikörper und inkubieren Sie ihn über Nacht.
Alle Tumorzellen wurden um das Array des Wellenchips herum eingefangen, ohne dass Zellen fehlten, was auf die hohe Einfangeffizienz des mikrofluidischen Chips hinweist. Hier sind Tumorzellen zu sehen, die mit Hoechst und Calcein AM gefärbt wurden. Hier sind CTCs eines Magenkrebspatienten zu sehen, die mit kleinen Ellipsen-Mikrofiltern aufgenommen wurden.
Außerdem werden CTCs von einem Darmkrebspatienten gezeigt, die mit trapezförmigen Mikrofiltern aufgenommen wurden und sowohl blaue als auch grüne Fluoreszenz emittieren. Eine hohe Abscheideeffizienz und Lebensfähigkeit wurde für Tumorzellen beobachtet, die mit Mikrofiltern mit großen Ellipsen eingefangen wurden. Die klinische Immunfluoreszenzanalyse kolorektaler CTCs, die auf dem Mikrofluidik-Chip erfasst wurden, erkannte CTCs als DAPI-positiv, CK-positiv, CD45-negativ und die Leukozyten als DAPI-positiv, CK-negativ und CD45-positiv.
Hier sind kolorektale Tumorzellen zu sehen, die nach dem Einfangen auf dem großen Ellipsenchip kultiviert wurden, und kolorektale Tumorzellen, die auf den Mikrofiltern der großen Ellipse eingefangen wurden. Diese Methode der Modifikation mit Aptamer bietet einen neuen Ansatz zur Anreicherung der CTC-Isolierung.
