이 프로토콜은 적혈구 세포 계수 및 임상적 CTC 단리를 위한 방법을 기술하였다. 시작하기 위해, 종양 세포 MCF-7, MDA-MB-231 및 HeLa를 세포 배양 플라스크에서 10 내지 5 회 DMEM에서 1 회 10 내지 5 회 배양하고, 10 % 태아 소 혈청 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신으로 보충한다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 세포를 배양합니다.
세포주가 95% 합류할 때까지 부착성 단층으로 성장하면 0.25% 트립신 용액으로 2분 동안 배양 접시에서 세포주를 분리합니다. 3 마이크로 리터의 Calcein AM을 첨가하여 종양 세포를 염색하고 접시를 30 분 동안 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 모든 세포를 트립신으로 소화하십시오.
배양된 종양 세포를 세포 계수 챔버로 PBS에서 계수하고, PBS 1밀리리터당 100개의 종양 세포가 얻어질 때까지 희석한다. 다음에, 희석된 세포 현탁액을 다양한 유속의 주사기 펌프가 있는 주사기를 사용하여 미세유체 칩 내로 도입한다. 다양한 유량에 대한 포집 효율을 구하고 최적의 유량을 결정합니다.
칩에 포획되고 출구에서 유출되는 종양 세포의 수를 세십시오. 주어진 공식을 사용하여 캡처 효율을 계산합니다. 이 절차를 반복하여 10에서 100까지 다양한 수의 종양 세포에 대한 포획 효율을 얻습니다.
희귀 한 수의 종양 세포에 대해 미세 유체 칩을 테스트하고 검증합니다. 희석된 종양 세포를 흡인하기 위해 마이크로피펫 풀러로 만든 속이 빈 바늘을 사용하여 이 10개의 샘플 현탁액을 미세유체 칩에 주입합니다. 칩에 캡처한 후 각 샘플에 대한 종양 세포의 수를 감지하고 열거합니다.
다음으로, 종양 세포를 Calcein AM으로 염색하고, 5 마이크로 리터의 PBS에서 100 개의 종양 세포를 열거한다. 이 세포를 1 밀리리터의 전체 정상 혈액 샘플에 스파이크합니다. 이 세포를 칩에 도입하고 녹색 면역 형광으로 칩에 포획 된 종양 세포의 수를 열거합니다.
설명된 대로 생체 내 열거를 수행하고, 포획 후 포획 효율을 계산한다. 염색 없이 1개에서 10개의 종양 세포를 열거합니다. 이 세포들을 1 밀리리터의 전체 정상 혈액으로 스파이크하십시오.
이들 샘플을 미세유체 칩에 도입하고, 종양 세포를 포획한다. 20 내지 30 마이크로리터의 PBS에 3 내지 5 마이크로리터의 형광 염료를 첨가하고, 이 용액을 주사기로 칩에 도입한다. 칩에 포획된 종양 세포의 수를 청색 및 녹색 면역형광법으로 열거하여 포획 효율을 결정합니다.
다음으로, 상피 세포 부착 방지 분자의 친화성 기반 포획을 위해 실온에서 45분 동안 100마이크로리터의 4%3-메르캅토프로필 트리메톡시실란과 에탄올로 칩 표면을 수정합니다. 배양이 끝나면 칩을 에탄올로 세 번 씻으십시오. 그런 다음 100 마이크로 리터의 커플 링제 GMBS를 추가하고 30 분 동안 상호 작용하도록합니다.
배양이 끝나면 주사기를 사용하여 1 밀리리터의 PBS로 칩을 3 회 세척합니다. 실온에서 30분 동안 밀리리터당 10마이크로그램의 뉴트라비딘 30 내지 40마이크로리터로 칩을 처리하여, 세포를 GMBS 상에 고정화시킨 다음, PBS로 플러시하여 과량의 아비딘을 제거한다. 칩을 3-마이크로리터의 항-비오티닐화 상피 세포 접착 분자 항체로 수정하고, 밤새 배양한다.
모든 종양 세포는 어떠한 세포도 누락되지 않고 웨이브 칩의 어레이 주위에 포획되었으며, 이는 미세유체 칩의 높은 포획 효율을 나타낸다. Hoechst 및 Calcein AM으로 염색된 종양 세포가 여기에 표시됩니다. 작은 타원 마이크로 필터를 사용하여 캡처한 위암 환자의 CTC가 여기에 표시됩니다.
또한 사다리꼴 마이크로 필터를 사용하여 캡처하고 청색 및 녹색 형광을 모두 방출하는 대장암 환자의 CTC가 표시됩니다. 큰 타원 마이크로필터를 사용하여 포획된 종양 세포에 대해 높은 포획 효율 및 생존력이 관찰되었습니다. 미세유체 칩에 포획된 결장직장 CTC의 임상 면역형광 분석은 CTC를 DAPI 양성, CK 양성, CD45 음성으로, WBC를 DAPI 양성, CK 음성, CD45 양성으로 인식했습니다.
포획 후 큰 타원 칩 상에서 배양된 결장직장 종양 세포와 큰 타원 마이크로필터에 포획된 결장직장 종양 세포가 여기에 도시되어 있다. 앱타머로 변형하는 이 방법은 CTC 분리를 풍부하게 하는 새로운 접근 방식을 제공합니다.
