Este protocolo descreveu um método para a enumeração de hemácias tumorais e o isolamento clínico da CTC. Para começar, cultivar as células tumorais MCF-7, MDA-MB-231 e HeLa em frasco de cultura celular de uma vez 10 a quinto em um milímetro de DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Quando as linhagens celulares crescerem como monocamadas aderentes a 95% de confluência, retire-as da placa de cultura com solução de tripsina a 0,25% por dois minutos. Manchar as células tumorais adicionando três microlitros de Calcein AM e colocar a placa na incubadora por 30 minutos. No final da incubação, digerir todas as células com tripsina.
Contar as células tumorais de cultura em PBS com uma câmara de contagem de células e diluir até obter 100 células tumorais por mililitro de PBS. Em seguida, introduza a suspensão de células diluídas no chip microfluídico usando uma seringa com uma bomba de seringa em taxas de fluxo variadas. Obtenha a eficiência de captura para as várias taxas de fluxo e determine a taxa de fluxo ideal.
Conte o número de células tumorais capturadas no chip e que fluem da saída. Calcule a eficiência de captura usando a fórmula fornecida. Repetir o procedimento para obter a eficiência de captura para diferentes números de células tumorais, de 10 a 100.
Testar e validar o chip microfluídico para um número raro de células tumorais. Injete essas 10 suspensões de amostra nos chips microfluídicos usando uma agulha oca feita com um extrator de micropipeta para aspirar células tumorais diluídas. Detectar e enumerar o número de células tumorais para cada amostra após sua captura no chip.
Em seguida, corar as células tumorais com Calcein AM e enumerar 100 células tumorais em cinco microlitros de PBS. Spike essas células em um mililitro de amostra de sangue inteiro e normal. Introduza essas células no chip e enumere o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência verde.
Execute a enumeração in vivo conforme descrito e calcule a eficiência de captura após a captura. Enumerar de uma a 10 células tumorais sem colorir. Spike essas células em um mililitro de sangue total e normal.
Introduza essas amostras no chip microfluídico e capture as células tumorais. Adicione três a cinco microlitros de corante fluorescente em 20 a 30 microlitros de PBS e introduza esta solução no chip com uma seringa. Enumerar o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência azul e verde para determinar a eficiência de captura.
Em seguida, modifique a superfície do chip com 100 microlitros de trimetoxisilano 4%3-mercaptopropil e etanol à temperatura ambiente por 45 minutos para a captura baseada em afinidade da molécula de adesão de células antiepiteliais. Ao final da incubação, lave o cavaco três vezes com etanol. Em seguida, adicione 100 microlitros do agente de acoplamento GMBS e deixe interagir por 30 minutos.
No final da incubação, use uma seringa para lavar o chip três vezes com um mililitro de PBS. Trate o chip com 30 a 40 microlitros de 10 microgramas por mililitro neutravidin à temperatura ambiente por 30 minutos, levando à imobilização das células no GMBS, e depois lave com PBS para remover o excesso de avidina. Modifique o chip com três microlitros de anticorpo anti-molécula de adesão de células epiteliais biotiniladas e incube durante a noite.
Todas as células tumorais foram capturadas ao redor da matriz do chip de onda sem nenhuma célula ausente, indicando a alta eficiência de captura do chip microfluídico. Células tumorais coradas com Hoechst e Calcein AM são mostradas aqui. CTCs de um paciente com câncer gástrico capturados usando pequenos microfiltros de elipse são mostrados aqui.
Além disso, CTCs de um paciente com câncer colorretal capturados usando microfiltros trapézios, e emitindo fluorescência azul e verde, são mostrados. Alta eficiência de captura e viabilidade foram observadas para células tumorais capturadas usando microfiltros de elipse grande. A análise clínica por imunofluorescência das CTCs colorretais capturadas no chip microfluídico reconheceu as CTCs como DAPI-positivas, CK-positivas, CD45-negativas e os leucócitos como DAPI-positivos, CK-negativos, CD45-positivos.
Células tumorais colorretais cultivadas no chip de elipse grande após a captura, e células tumorais colorretais capturadas nos microfiltros de elipse grande são mostradas aqui. Este método de modificação com aptâmero fornece uma nova abordagem para enriquecer o isolamento da CTC.
