在固体培养基上长期培养单个 秀丽隐杆线虫 ，用于纵向荧光监测和厌恶干预

虽然存在其他固体培养方法，但这是第一个固体培养系统，可以在一个系统中自动纵向跟踪个体动物的生命和健康跨度以及荧光生物标志物的纵向成像。该协议提供与固体NGM上的标准秀丽隐杆线虫实验相当的结果，与厌恶干预和直接实时荧光成像兼容。该系统对于衰老研究将是无价的，特别是关于长期暴露于环境压力源和长期观察基因和蛋白质动力学。

避免污染和在井中实现一致的干燥都是具有挑战性的。我们强调了书面协议中的关键点，以尽量减少这些问题。首先，在研钵和研杵中研磨500毫克固体棕榈酸。

将其与 15 毫升吐温 20 在 50 毫升锥形小瓶中混合，并通过涡旋混合以溶解晶体。加入17.5毫升100%乙醇，涡旋溶液以溶解尽可能多的棕榈酸。然后加入17.5毫升超纯水，剧烈涡旋。

在80摄氏度的珠浴中轻轻加热溶液，直到棕榈酸完全溶解。将珠浴重新加热至 80 摄氏度。使用前，将每个微托盘中的棕榈酸工作溶液分装一毫升到单独的无菌容器中，并在加热前每一毫升棕榈酸溶液中加入四微升制霉菌素。

现在用乙醇在微托盘内外喷洒至饱和，然后甩掉多余的乙醇。要对微托盘进行灭菌，请将板和盖子分别放入UV交联剂中。20分钟后，翻转盘子和盖子。

接下来，将装有棕榈酸工作溶液的15毫升锥形小瓶放入珠浴中，并在使用前让任何可见晶体完全溶解。将微托盘放在珠浴周围的壁架上并盖上盖子两分钟，以预热微托盘。取下微托盘盖，在微托盘后壁上缓慢加入200微升棕榈酸工作溶液。

盖上盖子，让微托盘在珠浴上放置两到三分钟，让棕榈酸溶液沉淀在微托盘的底部。将微托盘旋转180度，然后如前所述加入棕榈酸工作溶液。通过添加手稿中描述的组件来制备lmNGM。

然后将 20 微升 lmNGM 移液到放置在工作台上的每个微托盘中。重新填充移液器时，请务必盖上微量托盘，以尽量减少污染。为了用细菌食物播种微托盘孔，将以3， 500 G生长过夜的培养物离心20分钟。

除去上清液，并用85毫摩尔氯化钠溶液以十倍浓度重悬细菌培养物。然后小心地将五微升十倍浓缩的细菌培养物移液到每个孔中的lmNGM表面上。避免让细菌培养物越过孔的侧面并进入棕榈酸，因为这会吸引蠕虫离开孔。

将无菌3D打印插入物放入无菌单孔板中。将微托盘放入单孔板中的3D打印适配器中。在微托盘外孔和单孔板内壁之间的3D打印插入物顶部自由分配水晶体。

如果没有立即添加蠕虫，请密封微托盘以备第二天使用。合上托盘盖，用单片封口膜包裹所有四个侧面以密封微托盘。用石蜡膜重复密封步骤两次，共三层。

一旦它们达到所需的生命阶段，每孔添加一个蠕虫。将40微升洗涤剂溶液加入单孔板的盖子上，并使用工作擦拭均匀地涂覆盖子。使用额外的工作湿巾涂抹洗涤剂溶液，直到通过盖子的视力不失真。

稍微拉伸第一片石蜡像，以覆盖托盘的两侧。用任务擦拭擦拭托盘顶部，并用 70% 乙醇将其浸湿以去除任何指纹。通过轻轻敲击盘子的侧面或顶部，或在盘子上照射明亮的蓝光并观察每只动物来测量寿命。

如果动物在几秒钟内没有移动，则对其进行评分。每隔一到三天重复一次此任务，直到所有蠕虫都死亡。对单孔进行荧光成像。

暴露于硫酸铜和二硫苏糖醇会显着缩短蠕虫的寿命和健康寿命。相比之下，硫酸铜降低了健康生活的比例，而二硫苏糖醇则没有。硫酸铜在所有年龄段降低人群中个体的平均活性的程度大于二硫苏糖醇。

终生活动曲线下个体动物面积的种群平均值受到硫酸铜或二硫苏糖醇的显着损害。个体动物的累积活动直到第10天与二硫苏糖醇挑战动物的寿命相关，但与未处理的对照或硫酸铜攻击动物的寿命无关。在成年期的第3天和第8天之间观察到KYNU-1表达急剧增加，之后随着年龄的增长而逐渐下降。

成年期第14天的累积KYNU-1 mScarlet表达与动物寿命相关。由于KYNU-1的表达在整个生命周期中都是动态的，我们将不同年龄的KYNU-1表达与个体动物的总生存率进行了比较。没有一个时间点KYNU-1表达与存活率显着相关。

尝试此过程时，最重要的步骤是添加棕榈酸，移液琼脂并引入蠕虫。该技术允许纵向跟踪寿命和健康寿命，以及单个蠕虫中的荧光生物标志物，其方式可直接与NGM测定相媲美。