Embora existam outros métodos de cultura sólida, este é o primeiro sistema de cultura sólida que permite o rastreamento longitudinal automatizado da vida e saúde animal individual e imagens longitudinais de biomarcadores fluorescentes em um sistema. Este protocolo fornece resultados comparáveis aos experimentos padrão de C.elegans em NGM sólido é compatível com intervenções aversivas e imagens diretas de fluorescência ao vivo. Este sistema será inestimável para a pesquisa do envelhecimento, especialmente no que diz respeito à exposição a longo prazo a estressores ambientais e à observação da dinâmica de genes e proteínas por longos períodos.
Evitar a contaminação e obter secagem consistente nos poços são ambos um desafio. Destacamos pontos-chave no protocolo escrito para minimizar essas questões. Para começar, triture 500 miligramas de ácido palmítico sólido em uma argamassa e pilão.
Combine-o com 15 mililitros de TWEEN 20 num frasco cónico de 50 mililitros e misture por vórtice para dissolver os cristais. Adicione 17,5 mililitros de etanol a 100% e agite a solução para dissolver o máximo possível de ácido palmítico. Em seguida, adicione 17,5 mililitros de água ultrapura e vórtice vigorosamente.
Aqueça suavemente a solução num banho de contas a 80 graus Celsius até que o ácido palmítico se dissolva completamente. Reaqueça o banho de contas a 80 graus Celsius. Imediatamente antes de usar, aliquote um mililitro da solução de trabalho de ácido palmítico por Microbandeja em um recipiente estéril separado e adicione quatro microlitros de nistatina por um mililitro de solução de ácido palmítico antes de aquecer.
Agora borrife dentro e fora da Microbandeja com etanol até a saturação e sacuda o excesso de etanol. Para esterilizar a Microbandeja, coloque a placa e a tampa separadamente no reticulante UV. Após 20 minutos, vire o prato e a tampa.
Em seguida, coloque o frasco cônico de 15 mililitros com a solução de trabalho de ácido palmítico no banho de contas e deixe que os cristais visíveis se dissolvam completamente antes de usar. Aqueça a Microbandeja colocando-a na borda ao redor do banho de contas com as tampas ligadas por dois minutos. Remova a tampa da Microbandeja e adicione lentamente 200 microlitros de solução de trabalho de ácido palmítico na parede traseira da Microbandeja.
Substitua as tampas e deixe a Microbandeja descansar no banho de contas por dois a três minutos para permitir que a solução de ácido palmítico se acomode no fundo da Microbandeja. Gire a microbandeja 180 graus e adicione a solução de trabalho de ácido palmítico conforme demonstrado anteriormente. Prepare o lmNGM adicionando os componentes descritos no manuscrito.
Em seguida, pipetar 20 microlitros de lmNGM em cada Microbandeja colocada na bancada. Certifique-se de cobrir a Microbandeja ao reabastecer a pipeta para minimizar a contaminação. Para semear os poços Microtray com alimentos bacterianos, centrifugar uma cultura cultivada durante a noite a 3.500 G por 20 minutos.
Remover o sobrenadante e ressuspender a cultura bacteriana em uma concentração dez vezes maior com solução de cloreto de sódio 85 milimolar. Em seguida, pipete cuidadosamente cinco microlitros de cultura bacteriana concentrada dez vezes na superfície do lmNGM em cada poço. Evite permitir que a cultura de bactérias passe pelo lado do poço e entre no ácido palmítico, pois isso atrairá vermes para deixar o poço.
Coloque a pastilha estéril impressa em 3D em uma placa estéril de poço único. Coloque a Microbandeja no adaptador impresso em 3D na placa de poço único. Distribua generosamente cristais de água sobre a pastilha impressa em 3D entre o poço externo da Microbandeja e a parede interna da placa de poço único.
Se os worms não estiverem sendo adicionados imediatamente, sele a Microbandeja para usar no dia seguinte. Feche a tampa da bandeja e use um único pedaço de Parafilm para envolver todos os quatro lados para selar a Microbandeja. Repita a etapa de vedação com Parafilm mais duas vezes para três camadas.
Adicione um verme por poço assim que eles atingirem o estágio de vida desejado. Adicione 40 microlitros de solução de detergente à tampa de um único prato de poço único e use um lenço de limpeza para revestir a tampa uniformemente. Use lenços de limpeza de tarefa adicionais para espalhar a solução de detergente até que a visão através da tampa não seja distorcida.
Estique levemente o primeiro pedaço de Parafilm para cobrir dois lados da bandeja. Limpe a parte superior da bandeja com um limpador de tarefas e umedeça-a com etanol 70% para remover as impressões digitais. Meça o tempo de vida batendo suavemente na lateral ou na parte superior da placa, ou brilhando uma luz azul brilhante na placa e observando cada animal.
Marcar um animal morto se ele não se mover dentro de alguns segundos. Repita esta tarefa a cada um ou três dias até que todos os vermes tenham morrido. Realizar imagens fluorescentes em poços individuais.
A exposição ao sulfato de cobre e ao ditiotreitol reduziu significativamente a vida útil e o tempo de saúde do verme. Em contraste, o sulfato de cobre diminuiu a proporção de vida gasta em boa saúde, enquanto o ditiotreitol não. O sulfato de cobre reduziu a atividade média entre os indivíduos dentro da população em maior extensão do que o ditiotreitol em todas as idades.
A média populacional da área animal individual sob a curva de atividade ao longo da vida é substancialmente prejudicada pelo sulfato de cobre ou ditiotreitol. A atividade cumulativa para animais individuais até o dia 10 correlaciona-se com sua expectativa de vida para animais desafiados com ditiotreitol, mas não para controles não tratados ou animais desafiados com sulfato de cobre. Um aumento drástico na expressão de KYNU-1 é observado entre os dias três e oito da idade adulta, e há um declínio progressivo com a idade após isso.
A expressão cumulativa de KYNU-1 mScarlet até o 14º dia da idade adulta correlaciona-se com a expectativa de vida dos animais. Como a expressão de KYNU-1 é dinâmica ao longo de toda a vida, comparamos a expressão de KYNU-1 em diferentes idades com a sobrevivência global em animais individuais. Em nenhum momento a expressão de KYNU-1 se correlacionou significativamente com a sobrevida.
Ao tentar este procedimento, os passos mais importantes são a adição do ácido palmítico, pipetagem do ágar e introdução dos vermes. Esta técnica permite o rastreamento longitudinal da expectativa de vida e da saúde, bem como biomarcadores fluorescentes em vermes individuais de uma forma que é diretamente comparável aos ensaios de NGM.
