В то время как существуют другие методы твердого культивирования, это первая система твердого культивирования, которая позволяет автоматизировать продольное отслеживание жизни и здоровья отдельных животных и продольную визуализацию флуоресцентных биомаркеров в одной системе. Этот протокол обеспечивает результаты, сопоставимые со стандартными экспериментами C.elegans на твердом NGM, совместим как с аверсивными вмешательствами, так и с прямой флуоресцентной визуализацией в реальном времени. Эта система будет иметь неоценимое значение для исследований старения, особенно в отношении долгосрочного воздействия стрессоров окружающей среды и наблюдения за динамикой генов и белков в течение длительных периодов времени.
Избежать загрязнения и обеспечить постоянное высыхание скважин - сложная задача. Мы выделили ключевые моменты в письменном протоколе, чтобы свести к минимуму эти проблемы. Для начала измельчите 500 миллиграмм твердой пальмитиновой кислоты в ступке и пестиком.
Смешайте его с 15 миллилитрами TWEEN 20 в коническом флаконе объемом 50 миллилитров и смешайте вихревым способом, чтобы растворить кристаллы. Добавьте 17,5 миллилитров 100% этанола и встряхните раствор, чтобы растворить как можно больше пальмитиновой кислоты. Затем добавьте 17,5 миллилитров сверхчистой воды и энергично встряхните.
Осторожно нагрейте раствор в ванне для шариков при температуре 80 градусов Цельсия до полного растворения пальмитиновой кислоты. Разогрейте ванну с шариками до 80 градусов Цельсия. Непосредственно перед использованием аликвотируйте один миллилитр рабочего раствора пальмитиновой кислоты на микролоток в отдельный стерильный контейнер и добавьте четыре микролитра нистатина на один миллилитр раствора пальмитиновой кислоты перед нагреванием.
Теперь распылите внутри и снаружи микролотка этанол до насыщения и стряхните излишки этанола. Чтобы стерилизовать микролоток, поместите пластину и крышку отдельно в УФ-сшивающий агент. Через 20 минут переверните тарелку и крышку.
Затем поместите 15-миллилитровый конический флакон с рабочим раствором пальмитиновой кислоты в ванну для шариков и дайте всем видимым кристаллам полностью раствориться перед использованием. Разогрейте микролоток, поместив его на выступ, окружающий ванну с шариками, с закрытыми крышками на две минуты. Снимите крышку микролотка и медленно добавьте 200 микролитров рабочего раствора пальмитиновой кислоты через заднюю стенку микролотка.
Закройте крышки и оставьте микролоток на ванну с шариками на две-три минуты, чтобы раствор пальмитиновой кислоты осяд на дно микролотка. Поверните микролоток на 180 градусов и добавьте рабочий раствор пальмитиновой кислоты, как показано ранее. Подготовьте lmNGM, добавив компоненты, описанные в рукописи.
Затем пипеткой налейте 20 микролитров lmNGM в каждый микролоток, размещенный на столе. Обязательно накрывайте микролоток при заправке пипетки, чтобы свести к минимуму загрязнение. Чтобы засеять лунки Микролотка бактериальным кормом, центрифугируйте культуру, выращенную в течение ночи при температуре 3 500 г в течение 20 минут.
Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте культуру бактерий в десятикратной концентрации 85-миллимолярным раствором хлорида натрия. Затем осторожно нанесите пять микролитров десятикратно концентрированной бактериальной культуры на поверхность lmNGM в каждой лунке. Не допускайте, чтобы культура бактерий стекала через стенку колодца и попадала в пальмитиновую кислоту, так как это привлечет червей, покидающих колодец.
Поместите стерильный вкладыш, напечатанный на 3D-принтере, в стерильную однолуночную пластину. Поместите микролоток в адаптер, напечатанный на 3D-принтере, на однолуночной пластине. Обильно распределите кристаллы воды поверх 3D-печатной вставки между внешним отверстием микролотка и внутренней стенкой однолуночной пластины.
Если черви не добавляются сразу, запечатайте микролоток, чтобы использовать его на следующий день. Закройте крышку лотка и используйте один кусок парапленки, чтобы обернуть все четыре стороны, чтобы запечатать микролоток. Повторите этап запечатывания с помощью Parafilm еще два раза для трех слоев.
Добавьте по одному червю в лунку, как только они достигнут желаемой стадии жизни. Добавьте 40 микролитров раствора моющего средства в крышку однолунной пластины и используйте рабочую салфетку, чтобы равномерно покрыть крышку. Используйте дополнительные салфетки, чтобы распределить раствор моющего средства до тех пор, пока зрение через крышку не исказится.
Слегка растяните первый кусок парапленки, чтобы покрыть две стороны лотка. Протрите верхнюю часть лотка рабочей салфеткой и смочите ее 70% этанолом, чтобы удалить отпечатки пальцев. Измерьте продолжительность жизни, осторожно постукивая по боковой или верхней части тарелки или светя ярко-синим светом на тарелку и наблюдая за каждым животным.
Забейте животное мертвым, если оно не двигается в течение нескольких секунд. Повторяйте эту задачу каждые один-три дня, пока все черви не погибнут. Выполняйте флуоресцентную визуализацию на отдельных лунках.
Воздействие сульфата меди и дитиотреитола значительно сокращало продолжительность жизни и здоровье червей. Напротив, сульфат меди уменьшал долю жизни, проведенной в добром здравии, в то время как дитиотреитол этого не делал. Сульфат меди снижал среднюю активность у людей в популяции в большей степени, чем дитиотреитол во всех возрастах.
Средняя популяция отдельного животного под кривой пожизненной активности существенно ухудшается сульфатом меди или дитиотреитолом. Кумулятивная активность для отдельных животных до 10-го дня коррелирует с их продолжительностью жизни для животных, подвергавшихся дитиотреитолу, но не для необработанных контрольных животных или животных, подвергшихся воздействию сульфата меди. Резкое увеличение экспрессии KYNU-1 наблюдается между третьим и восьмым днями взрослой жизни, и после этого наблюдается прогрессирующее снижение с возрастом.
Кумулятивная экспрессия KYNU-1 mScarlet на 14-й день взрослой жизни коррелирует с продолжительностью жизни животных. Поскольку экспрессия KYNU-1 динамична на протяжении всей жизни, мы сравнили экспрессию KYNU-1 в разном возрасте с общей выживаемостью отдельных животных. Ни в один момент времени экспрессия KYNU-1 не коррелировала с выживаемостью.
При попытке этой процедуры наиболее важными шагами являются добавление пальмитиновой кислоты, пипетка агара и введение червей. Этот метод позволяет продольно отслеживать продолжительность жизни и продолжительность здоровья, а также флуоресцентные биомаркеры у отдельных червей таким образом, который напрямую сопоставим с анализами NGM.
