Si bien existen otros métodos de cultivo sólido, este es el primer sistema de cultivo sólido que permite el seguimiento longitudinal automatizado de la vida y la salud de los animales individuales y la obtención de imágenes longitudinales de biomarcadores fluorescentes en un solo sistema. Este protocolo proporciona resultados comparables a los experimentos estándar de C.elegans en NGM sólido es compatible tanto con intervenciones aversivas como con imágenes directas de fluorescencia en vivo. Este sistema será invaluable para la investigación del envejecimiento, especialmente con respecto a la exposición a largo plazo a factores estresantes ambientales y la observación de la dinámica de genes y proteínas durante períodos prolongados.
Evitar la contaminación y obtener un secado constante en los pozos es un desafío. Destacamos los puntos clave en el protocolo escrito para minimizar estos problemas. Para comenzar, muele 500 miligramos de ácido palmítico sólido en un mortero.
Combínalo con 15 mililitros de TWEEN 20 en un vial cónico de 50 mililitros, y mezcla por vórtice para disolver los cristales. Agregue 17.5 mililitros de etanol al 100% y vortex la solución para disolver la mayor cantidad de ácido palmítico posible. Luego agregue 17.5 mililitros de agua ultrapura y vórtice vigorosamente.
Caliente suavemente la solución en un baño de perlas a 80 grados centígrados hasta que el ácido palmítico se disuelva por completo. Vuelva a calentar el baño de cuentas a 80 grados centígrados. Inmediatamente antes de usar, alícuota un mililitro de la solución de trabajo de ácido palmítico por Microbandeja en un recipiente estéril separado, y agregue cuatro microlitros de nistatina por un mililitro de solución de ácido palmítico antes de calentar.
Ahora rocíe dentro y fuera de la microbandeja con etanol hasta la saturación, y sacuda el exceso de etanol. Para esterilizar la microbandeja, coloque la placa y la tapa por separado en el reticulante UV. Después de 20 minutos, voltee el plato y la tapa.
A continuación, coloque el vial cónico de 15 mililitros con la solución de trabajo de ácido palmítico en el baño de perlas y permita que los cristales visibles se disuelvan completamente antes de su uso. Calienta la microbandeja colocándola en la repisa que rodea el baño de cuentas con las tapas puestas durante dos minutos. Retire la tapa de la microbandeja y agregue lentamente 200 microlitros de solución de trabajo de ácido palmítico a través de la pared posterior de la microbandeja.
Reemplace las tapas y deje que la microbandeja repose en el baño de perlas durante dos o tres minutos para permitir que la solución de ácido palmítico se asiente en la parte inferior de la microbandeja. Gire la microbandeja 180 grados y agregue la solución de trabajo de ácido palmítico como se demostró anteriormente. Prepare lmNGM agregando los componentes descritos en el manuscrito.
A continuación, pipetear 20 microlitros de lmNGM en cada microbandeja colocada en el banco. Asegúrese de cubrir la microbandeja cuando rellene la pipeta para minimizar la contaminación. Para sembrar los pocillos de Microbandeja con alimentos bacterianos, centrifugar un cultivo cultivado durante la noche a 3, 500 G durante 20 minutos.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el cultivo de bacterias a una concentración diez veces mayor con una solución de cloruro de sodio de 85 milimolares. Luego, pipetea cuidadosamente cinco microlitros de cultivo bacteriano concentrado diez veces mayor en la superficie del lmNGM en cada pocillo. Evite permitir que el cultivo de bacterias corra sobre el costado del pozo y hacia el ácido palmítico, ya que esto atraerá a los gusanos a abandonar el pozo.
Coloque el inserto estéril impreso en 3D en una placa estéril de un solo pozo. Coloque la microbandeja en el adaptador impreso en 3D en la placa de un solo pozo. Dispense generosamente cristales de agua en la parte superior del inserto impreso en 3D entre el pozo exterior de la microbandeja y la pared interior de la placa de un solo pozo.
Si los gusanos no se agregan inmediatamente, selle la microbandeja para usarla al día siguiente. Cierre la tapa de la bandeja y use una sola pieza de Parafilm para envolver los cuatro lados para sellar la microbandeja. Repita el paso de sellado con Parafilm dos veces más para tres capas.
Agregue un gusano por pozo una vez que hayan alcanzado la etapa de vida deseada. Agregue 40 microlitros de solución detergente a la tapa de un plato de un solo pocillo y use una toallita de tareas para cubrir la tapa de manera uniforme. Use toallitas de trabajo adicionales para extender la solución detergente hasta que la visión a través de la tapa no se distorsione.
Estire ligeramente la primera pieza de Parafilm para cubrir dos lados de la bandeja. Limpie la parte superior de la bandeja con una toallita de tareas y humedezca con etanol al 70% para eliminar las huellas dactilares. Mida la vida útil golpeando suavemente el costado o la parte superior del plato, o haciendo brillar una luz azul brillante en el plato y observando a cada animal.
Marca un animal muerto si no se mueve en unos pocos segundos. Repita esta tarea cada uno a tres días hasta que todos los gusanos hayan muerto. Realizar imágenes fluorescentes en pocillos individuales.
La exposición al sulfato de cobre y al ditiothreitol redujo significativamente la vida útil y la salud de los gusanos. En contraste, el sulfato de cobre disminuyó la proporción de vida pasada en buena salud, mientras que el ditiothreitol no lo hizo. El sulfato de cobre redujo la actividad promedio entre los individuos dentro de la población en mayor medida que el ditiothreitol en todas las edades.
El promedio poblacional del área animal individual bajo la curva de actividad de por vida se ve sustancialmente afectada por el sulfato de cobre o el ditiothreitol. La actividad acumulada para animales individuales hasta el día 10 se correlaciona con su vida útil para los animales desafiados con ditiothreitol, pero no para los controles no tratados o los animales desafiados con sulfato de cobre. Se observa un aumento drástico en la expresión de KYNU-1 entre los días tres y ocho de la edad adulta, y hay una disminución progresiva con la edad después de eso.
La expresión acumulativa de KYNU-1 mScarlet hasta el día 14 de la edad adulta se correlaciona con la vida útil de los animales. Dado que la expresión de KYNU-1 es dinámica a lo largo de la vida, comparamos la expresión de KYNU-1 a diferentes edades con la supervivencia general en animales individuales. En ningún momento la expresión de KYNU-1 se correlacionó significativamente con la supervivencia.
Al intentar este procedimiento, los pasos más importantes son la adición del ácido palmítico, el pipeteo del agar y la introducción de los gusanos. Esta técnica permite el seguimiento longitudinal de la vida útil y la duración de la salud, así como biomarcadores fluorescentes en gusanos individuales de una manera que es directamente comparable a los ensayos NGM.
