Diğer katı kültür yöntemleri mevcut olsa da, bu, bireysel hayvan yaşamının ve sağlık süresinin otomatik uzunlamasına izlenmesini ve floresan biyobelirteçlerin tek bir sistemde uzunlamasına görüntülenmesini sağlayan ilk katı kültür sistemidir. Bu protokol, katı NGM üzerindeki standart C.elegans deneyleriyle karşılaştırılabilir sonuçlar sağlar, hem önleyici müdahaleler hem de doğrudan canlı floresan görüntüleme ile uyumludur. Bu sistem, özellikle çevresel stresörlere uzun süreli maruz kalma ve uzun süreler boyunca gen ve protein dinamiklerini gözlemleme konusunda yaşlanma araştırmaları için paha biçilmez olacaktır.
Kirlenmeyi önlemek ve kuyular boyunca tutarlı kurutma sağlamak zordur. Bu sorunları en aza indirmek için yazılı protokoldeki kilit noktaları vurguladık. Başlamak için, bir harç ve havanede 500 miligram katı palmitik asit öğütün.
50 mililitrelik konik bir şişede 15 mililitre TWEEN 20 ile birleştirin ve kristalleri çözmek için vorteks yaparak karıştırın. 17.5 mililitre% 100 etanol ekleyin ve mümkün olduğunca fazla palmitik asidi çözmek için çözeltiyi vorteks. Sonra 17.5 mililitre ultra saf su ekleyin ve kuvvetlice girdap yapın.
Çözeltiyi, palmitik asit tamamen çözünene kadar 80 santigrat derecede bir boncuk banyosunda hafifçe ısıtın. Boncuk banyosunu tekrar 80 santigrat dereceye ısıtın. Kullanımdan hemen önce, Mikrotepsi başına bir mililitre palmitik asit çalışma çözeltisini ayrı bir steril kaba alın ve ısıtmadan önce bir mililitre palmitik asit çözeltisi başına dört mikrolitre nistatin ekleyin.
Şimdi Mikro Tepsinin içine ve dışına doygunluğa kadar etanol püskürtün ve fazla etanolün çalkalanması. Microtray'ı sterilize etmek için, plakayı ve kapağı ayrı ayrı UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin. 20 dakika sonra plakayı ve kapağı çevirin.
Daha sonra, 15 mililitrelik konik şişeyi palmitik asit çalışma çözeltisi ile boncuk banyosuna yerleştirin ve görünür kristallerin kullanımdan önce tamamen çözünmesine izin verin. Microtray'ı, kapakları açıkken boncuk banyosunu çevreleyen çıkıntıya yerleştirerek iki dakika boyunca ısıtın. Mikrotepsi kapağını çıkarın ve yavaşça Mikrotepsinin arka duvarına 200 mikrolitre palmitik asit çalışma solüsyonu ekleyin.
Kapakları değiştirin ve palmitik asit çözeltisinin Mikro Tepsinin dibine yerleşmesini sağlamak için Mikro Tepsinin boncuk banyosunda iki ila üç dakika oturmasına izin verin. Mikrotepsiyi 180 derece döndürün ve daha önce gösterildiği gibi palmitik asit çalışma solüsyonunu ekleyin. Makalede açıklanan bileşenleri ekleyerek lmNGM'yi hazırlayın.
Daha sonra tezgaha yerleştirilen her bir Mikrotepsiye 20 mikrolitre lmNGM pipet yerleştirin. Kirlenmeyi en aza indirmek için pipeti yeniden doldururken Mikro Tepsiyi kapattığınızdan emin olun. Microtray kuyularını bakteriyel yiyeceklerle tohumlamak için, gece boyunca 3.500 G'de yetiştirilen bir kültürü 20 dakika boyunca santrifüj edin.
Süpernatanı çıkarın ve bakteri kültürünü 85 milimolar sodyum klorür çözeltisi ile on kat konsantrasyonda yeniden askıya alın. Daha sonra, her bir kuyucuktaki lmNGM'nin yüzeyine beş mikrolitre on kat konsantre bakteri kültürünü dikkatlice pipetin. Bakteri kültürünün kuyunun kenarından ve palmitik aside akmasına izin vermekten kaçının, çünkü bu, solucanları kuyudan ayrılmaya çekecektir.
Steril 3D baskılı kesici ucu steril tek delikli bir plakaya yerleştirin. Mikro Tepsiyi tek delikli plakadaki 3B yazdırılmış adaptöre yerleştirin. Su kristallerini, 3D baskılı kesici ucun üstüne, Microtray'ın dış kuyucuğu ile tek kuyucuklu plakanın iç duvarı arasında serbestçe dağıtın.
Solucanlar hemen eklenmiyorsa, ertesi gün kullanmak için Mikro Tepsiyi kapatın. Tepsi kapağını kapatın ve Mikro Tepsiyi kapatmak için dört tarafı da sarmak için tek bir Parafilm parçası kullanın. Sızdırmazlık adımını Parafilm ile üç katman için iki kez daha tekrarlayın.
İstenilen yaşam aşamasına ulaştıklarında kuyu başına bir solucan ekleyin. Tek kuyucuklu bir plakanın kapağına 40 mikrolitre deterjan çözeltisi ekleyin ve kapağı eşit şekilde kaplamak için bir görev mendili kullanın. Deterjan çözeltisini, kapaktan görme bozulmayana kadar yaymak için ek görev mendilleri kullanın.
Tepsinin iki tarafını örtmek için ilk Parafilm parçasını hafifçe gerin. Tepsinin üst kısmını bir görev mendili ile silin ve parmak izlerini çıkarmak için %70 etanol ile nemlendirin. Plakanın yan tarafına veya üstüne hafifçe dokunarak veya plaka üzerinde parlak mavi bir ışık parlatarak ve her hayvanı gözlemleyerek ömrü ölçün.
Birkaç saniye içinde hareket etmeyen bir hayvanı ölü olarak puanlayın. Tüm solucanlar ölene kadar bu görevi her bir ila üç günde bir tekrarlayın. Tek kuyucuklarda floresan görüntüleme yapın.
Bakır sülfat ve ditiyotreitol'e maruz kalmak, solucan ömrünü ve sağlık süresini önemli ölçüde azalttı. Buna karşılık, bakır sülfat, sağlıklı bir şekilde harcanan yaşamın oranını azaltırken, ditiyotreitol azaltmadı. Bakır sülfat, popülasyondaki bireyler arasındaki ortalama aktiviteyi, her yaşta ditiyotreitolden daha büyük ölçüde azaltmıştır.
Yaşam boyu aktivite eğrisi altındaki bireysel hayvan alanının popülasyon ortalaması, bakır sülfat veya ditiyotreitol tarafından önemli ölçüde bozulur. 10. güne kadar bireysel hayvanlar için kümülatif aktivite, ditiyotreitol ile mücadele eden hayvanlar için ömürleri ile ilişkilidir, ancak tedavi edilmemiş kontroller veya bakır sülfat ile mücadele eden hayvanlar için değildir. KYNU-1 ekspresyonunda yetişkinliğin üç ila sekizinci günleri arasında ciddi bir artış gözlenir ve bundan sonra yaşla birlikte ilerleyici bir düşüş olur.
Kümülatif KYNU-1 mYetişkinliğin 14. gününe kadar olan kırmızı ekspresyon, hayvan ömrü ile ilişkilidir. KYNU-1 ekspresyonu bir yaşam boyu dinamik olduğundan, farklı yaşlardaki KYNU-1 ekspresyonunu bireysel hayvanlarda genel sağkalım ile karşılaştırdık. Tek bir zaman noktasında KYNU-1 ekspresyonu sağkalım ile anlamlı bir korelasyon göstermedi.
Bu prosedürü denerken, en önemli adımlar palmitik asidin eklenmesi, agarın pipetlenmesi ve solucanların tanıtılmasıdır. Bu teknik, yaşam süresinin ve sağlık süresinin uzunlamasına izlenmesinin yanı sıra, bireysel solucanlardaki floresan biyobelirteçlerin NGM tahlilleriyle doğrudan karşılaştırılabilir bir şekilde izlenmesini sağlar.
