Sebbene esistano altri metodi di coltura solida, questo è il primo sistema di coltura solida che consente il monitoraggio longitudinale automatizzato della durata della vita e della salute dei singoli animali e l'imaging longitudinale di biomarcatori fluorescenti in un unico sistema. Questo protocollo fornisce risultati comparabili agli esperimenti standard di C.elegans su NGM solido è compatibile sia con interventi avversivi che con imaging a fluorescenza diretta dal vivo. Questo sistema sarà prezioso per la ricerca sull'invecchiamento, in particolare per quanto riguarda l'esposizione a lungo termine a fattori di stress ambientali e l'osservazione delle dinamiche geniche e proteiche per periodi prolungati.
Evitare la contaminazione e ottenere un'essiccazione costante attraverso i pozzi sono entrambi impegnativi. Abbiamo evidenziato i punti chiave del protocollo scritto per ridurre al minimo questi problemi. Per iniziare, macinare 500 milligrammi di acido palmitico solido in un mortaio e pestello.
Combinarlo con 15 millilitri di TWEEN 20 in una fiala conica da 50 millilitri e mescolare a vortice per sciogliere i cristalli. Aggiungere 17,5 millilitri di etanolo al 100% e vortice la soluzione per sciogliere quanto più acido palmitico possibile. Quindi aggiungere 17,5 millilitri di acqua ultrapura e vortice vigorosamente.
Riscaldare delicatamente la soluzione in un bagno di perline a 80 gradi Celsius fino a quando l'acido palmitico si dissolve completamente. Riscaldare il bagno di perline a 80 gradi Celsius. Immediatamente prima dell'uso, aliquotare un millilitro della soluzione di lavoro di acido palmitico per Microtray in un contenitore sterile separato e aggiungere quattro microlitri di nistatina per un millilitro di soluzione di acido palmitico prima del riscaldamento.
Ora spruzzare all'interno e all'esterno del Microtray con etanolo fino alla saturazione e scrollarsi di dosso l'etanolo in eccesso. Per sterilizzare il Microtray, posizionare la piastra e il coperchio separatamente nel reticolante UV. Dopo 20 minuti, capovolgere il piatto e il coperchio.
Quindi, posizionare la fiala conica da 15 millilitri con la soluzione di lavoro di acido palmitico nel bagno di perline e lasciare che eventuali cristalli visibili si dissolvano completamente prima dell'uso. Riscaldare il Microtray posizionandolo sulla sporgenza che circonda il bagno di perline con i coperchi per due minuti. Rimuovere il coperchio Microtray e aggiungere lentamente 200 microlitri di soluzione di lavoro di acido palmitico sulla parete posteriore del Microtray.
Riposizionare i coperchi e lasciare riposare il Microtray sul bagno di perline per due o tre minuti per consentire alla soluzione di acido palmitico di depositarsi sul fondo del Microtray. Ruotare il Microtray di 180 gradi e aggiungere la soluzione di lavoro di acido palmitico come dimostrato in precedenza. Preparare lmNGM aggiungendo i componenti descritti nel manoscritto.
Quindi pipettare 20 microlitri di lmNGM in ogni Microtray posizionato sul banco. Assicurarsi di coprire il Microtray quando si ricarica la pipetta per ridurre al minimo la contaminazione. Per seminare i pozzetti Microtray con cibo batterico, centrifugare una coltura coltivata durante la notte a 3.500 G per 20 minuti.
Rimuovere il surnatante e risospendere la coltura batterica a una concentrazione di dieci volte con una soluzione di cloruro di sodio a 85 millimolari. Quindi pipetare con cura cinque microlitri di coltura batterica concentrata di dieci volte sulla superficie del lmNGM in ciascun pozzetto. Evitare che la coltura batterica scorra sul lato del pozzo e nell'acido palmitico, poiché ciò attirerà i vermi a lasciare il pozzo.
Posizionare l'inserto sterile stampato in 3D in una piastra sterile a pozzetto singolo. Posizionare il Microtray nell'adattatore stampato in 3D nella piastra a pozzetto singolo. Erogare liberamente cristalli d'acqua sulla parte superiore dell'inserto stampato in 3D tra il pozzetto esterno del Microtray e la parete interna della piastra a pozzetto singolo.
Se i worm non vengono aggiunti immediatamente, sigillare il Microtray per utilizzarlo il giorno successivo. Chiudere il coperchio del vassoio e utilizzare un singolo pezzo di Parafilm per avvolgere tutti e quattro i lati per sigillare il Microtray. Ripetere la fase di sigillatura con Parafilm altre due volte per tre strati.
Aggiungi un verme per pozzetto una volta raggiunta la fase di vita desiderata. Aggiungere 40 microlitri di soluzione detergente al coperchio di una piastra a pozzetto singolo e utilizzare una salvietta per rivestire uniformemente il coperchio. Utilizzare salviette aggiuntive per distribuire la soluzione detergente fino a quando la visione attraverso il coperchio non viene distorta.
Allungare leggermente il primo pezzo di Parafilm per coprire due lati del vassoio. Pulire la parte superiore del vassoio con una salvietta da attività e inumidirla con etanolo al 70% per rimuovere eventuali impronte digitali. Misura la durata della vita toccando delicatamente il lato o la parte superiore del piatto, o facendo brillare una luce blu brillante sul piatto e osservando ogni animale.
Segna un animale morto se non si muove entro pochi secondi. Ripeti questo compito ogni uno o tre giorni fino a quando tutti i vermi sono morti. Eseguire immagini fluorescenti su singoli pozzetti.
L'esposizione al solfato di rame e al ditiotreitolo ha ridotto significativamente la durata della vita e la salute del verme. Al contrario, il solfato di rame ha diminuito la percentuale di vita trascorsa in buona salute, mentre il ditiotreitolo no. Il solfato di rame ha ridotto l'attività media tra gli individui all'interno della popolazione in misura maggiore rispetto al ditiotreitolo a tutte le età.
La media della popolazione della singola area animale sotto la curva dell'attività nel corso della vita è sostanzialmente compromessa dal solfato di rame o dal ditiotreitolo. L'attività cumulativa per i singoli animali fino al giorno 10 è correlata alla loro durata di vita per gli animali sottoposti a ditiotreitolo, ma non per i controlli non trattati o gli animali con solfato di rame. Un drastico aumento dell'espressione di KYNU-1 è osservato tra il terzo e l'ottavo giorno dell'età adulta, e c'è un progressivo declino con l'età successiva.
L'espressione cumulativa di KYNU-1 mScarlet fino al giorno 14 dell'età adulta è correlata alla durata della vita animale. Poiché l'espressione di KYNU-1 è dinamica per tutta la durata della vita, abbiamo confrontato l'espressione di KYNU-1 in età diverse con la sopravvivenza globale tra i singoli animali. In nessun singolo punto temporale l'espressione di KYNU-1 è stata significativamente correlata alla sopravvivenza.
Quando si tenta questa procedura, i passaggi più importanti sono l'aggiunta dell'acido palmitico, il pipettaggio dell'agar e l'introduzione dei vermi. Questa tecnica consente il monitoraggio longitudinale della durata della vita e della durata della salute, nonché biomarcatori fluorescenti nei singoli vermi in un modo che è direttamente paragonabile ai saggi NGM.
