Bien qu’il existe d’autres méthodes de culture solide, il s’agit du premier système de culture solide qui permet un suivi longitudinal automatisé de la vie et de la santé des animaux individuels et l’imagerie longitudinale de biomarqueurs fluorescents dans un seul système. Ce protocole fournit des résultats comparables aux expériences standard de C. elegans sur NGM solide et compatible avec les interventions aversives et l’imagerie directe par fluorescence en direct. Ce système sera inestimable pour la recherche sur le vieillissement, en particulier en ce qui concerne l’exposition à long terme aux facteurs de stress environnementaux et l’observation de la dynamique des gènes et des protéines sur de longues périodes.
Éviter la contamination et obtenir un séchage constant à travers les puits sont tous deux difficiles. Nous avons souligné les points clés du protocole écrit afin de minimiser ces problèmes. Pour commencer, broyez 500 milligrammes d’acide palmitique solide dans un mortier et un pilon.
Combinez-le avec 15 millilitres de TWEEN 20 dans un flacon conique de 50 millilitres et mélangez par vortex pour dissoudre les cristaux. Ajouter 17,5 millilitres d’éthanol à 100% et vortex la solution pour dissoudre autant d’acide palmitique que possible. Ajoutez ensuite 17,5 millilitres d’eau ultrapure et vortex vigoureusement.
Chauffer doucement la solution dans un bain de billes à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que l’acide palmitique se dissolve complètement. Réchauffez le bain de perles à 80 degrés Celsius. Immédiatement avant utilisation, aliquote d’un millilitre de solution de travail d’acide palmitique par microplateau dans un récipient stérile séparé et ajouter quatre microlitres de nystatine par millilitre de solution d’acide palmitique avant chauffage.
Maintenant, vaporisez à l’intérieur et à l’extérieur du microplateau avec de l’éthanol jusqu’à saturation et secouez l’excès d’éthanol. Pour stériliser le microplateau, placez la plaque et le couvercle séparément dans la réticulation UV. Après 20 minutes, retournez l’assiette et le couvercle.
Ensuite, placez le flacon de 15 millilitres avec la solution de travail d’acide palmitique dans le bain de billes et laissez les cristaux visibles se dissoudre complètement avant utilisation. Réchauffez le microplateau en le plaçant sur le rebord entourant le bain de perles avec les couvercles pendant deux minutes. Retirez le couvercle du microplateau et ajoutez lentement 200 microlitres de solution de travail à l’acide palmitique sur la paroi arrière du microplateau.
Replacez les couvercles et laissez le microplateau reposer sur le bain de billes pendant deux à trois minutes pour permettre à la solution d’acide palmitique de se déposer au fond du microplateau. Faites pivoter le microplateau de 180 degrés et ajoutez la solution de travail à l’acide palmitique comme démontré précédemment. Préparez lmNGM en ajoutant les composants décrits dans le manuscrit.
Ensuite, pipeter 20 microlitres de lmNGM dans chaque microplateau placé sur le banc. Assurez-vous de couvrir le microplateau lors du remplissage de la pipette pour minimiser la contamination. Pour ensemencer les puits Microtray avec de la nourriture bactérienne, centrifuger une culture cultivée pendant la nuit à 3 500 G pendant 20 minutes.
Retirer le surnageant et remettre en suspension la culture bactérienne à une concentration décuplée avec une solution de chlorure de sodium de 85 millimolaires. Ensuite, versez soigneusement cinq microlitres de culture bactérienne concentrée dix fois sur la surface du lmNGM dans chaque puits. Évitez de laisser la culture bactérienne couler sur le côté du puits et dans l’acide palmitique, car cela inciterait les vers à quitter le puits.
Placez l’insert stérile imprimé en 3D dans une plaque stérile à puits unique. Placez le microbac dans l’adaptateur imprimé en 3D dans la plaque à puits unique. Distribuez généreusement des cristaux d’eau sur le dessus de l’insert imprimé en 3D entre le puits extérieur du microplateau et la paroi interne de la plaque à puits unique.
Si les vers ne sont pas ajoutés immédiatement, scellez le microbac pour l’utiliser le lendemain. Fermez le couvercle du plateau et utilisez un seul morceau de Parafilm pour envelopper les quatre côtés afin de sceller le microplateau. Répétez l’étape d’étanchéité avec Parafilm deux fois de plus pour trois couches.
Ajoutez un ver par puits une fois qu’ils ont atteint le stade de vie souhaité. Ajoutez 40 microlitres de solution détergente au couvercle d’une plaque à puits unique et utilisez une lingette de travail pour enduire le couvercle uniformément. Utilisez des lingettes de travail supplémentaires pour étaler la solution détergente jusqu’à ce que la vision à travers le couvercle ne soit pas déformée.
Étirez légèrement le premier morceau de Parafilm pour couvrir deux côtés du plateau. Essuyez le haut du plateau avec une lingette de tâche et humidifiez-le avec de l’éthanol à 70% pour éliminer les empreintes digitales. Mesurez la durée de vie en tapotant doucement le côté ou le haut de la plaque, ou en faisant briller une lumière bleue brillante sur l’assiette et en observant chaque animal.
Marquez un animal mort s’il ne bouge pas en quelques secondes. Répétez cette tâche tous les un à trois jours jusqu’à ce que tous les vers soient morts. Effectuez une imagerie fluorescente sur des puits uniques.
L’exposition au sulfate de cuivre et au dithiothréitol a considérablement réduit la durée de vie et la durée de vie des vers. En revanche, le sulfate de cuivre a diminué la proportion de vie passée en bonne santé, alors que le dithiothréitol ne l’a pas fait. Le sulfate de cuivre a réduit l’activité moyenne chez les individus de la population dans une plus grande mesure que le dithiothréitol à tous les âges.
La moyenne de la population de la zone animale individuelle sous la courbe d’activité de la vie est considérablement altérée par le sulfate de cuivre ou le dithiothréitol. L’activité cumulative pour les animaux individuels jusqu’au jour 10 est en corrélation avec leur durée de vie pour les animaux exposés au dithiothréitol, mais pas pour les témoins non traités ou les animaux exposés au sulfate de cuivre. Une augmentation drastique de l’expression de KYNU-1 est observée entre les jours trois et huit de l’âge adulte, et il y a une diminution progressive avec l’âge après cela.
L’expression cumulative de KYNU-1 mScarlet jusqu’au jour 14 de l’âge adulte est en corrélation avec la durée de vie des animaux. Étant donné que l’expression de KYNU-1 est dynamique tout au long de la vie, nous avons comparé l’expression de KYNU-1 à différents âges à la survie globale des animaux individuels. À aucun moment donné, l’expression de KYNU-1 n’a été significativement corrélée à la survie.
Lors de la tentative de cette procédure, les étapes les plus importantes sont l’ajout de l’acide palmitique, le pipetage de l’agar et l’introduction des vers. Cette technique permet un suivi longitudinal de la durée de vie et de la durée de santé, ainsi que des biomarqueurs fluorescents chez des vers individuels d’une manière directement comparable aux tests NGM.
