다른 고체 배양 방법이 존재하지만, 이것은 하나의 시스템에서 개별 동물의 생명과 건강 기간에 대한 자동화된 종단 추적과 형광 바이오마커의 종단 이미징을 가능하게 하는 최초의 고체 배양 시스템입니다. 이 프로토콜은 고체 NGM에 대한 표준 C.elegans 실험과 유사한 결과를 제공하며 혐오 개입 및 직접 라이브 형광 이미징 모두와 호환됩니다. 이 시스템은 노화 연구, 특히 환경 스트레스 요인에 장기간 노출되고 장기간에 걸친 유전자 및 단백질 역학 관찰과 관련하여 매우 중요합니다.
오염을 피하고 유정 전체에서 일관된 건조를 얻는 것은 모두 어려운 일입니다. 우리는 이러한 문제를 최소화하기 위해 작성된 프로토콜에서 핵심 사항을 강조했습니다. 시작하려면 박격포와 유봉에 500 밀리그램의 고체 팔 미트 산을 갈아서 부순다.
50 밀리리터의 원추형 바이알에 15 밀리리터의 TWEEN 20과 결합하고 소용돌이에 의해 혼합하여 결정을 용해시킵니다. 17.5 밀리리터의 100 % 에탄올을 첨가하고 용액을 소용돌이 치면 가능한 한 많은 팔 미트 산이 용해됩니다. 그런 다음 17.5 밀리리터의 초순수를 넣고 격렬하게 소용돌이칩니다.
팔미트산이 완전히 용해될 때까지 섭씨 80도의 비드 수조에서 용액을 부드럽게 가열합니다. 비드 수조를 섭씨 80도까지 재가열합니다. 사용 직전에 마이크로트레이당 팔미트산 작업 용액 1밀리리터를 별도의 멸균 용기에 분취하고 가열하기 전에 팔미트산 용액 1밀리리터당 니스타틴 4마이크로리터를 추가합니다.
이제 마이크로트레이 내부와 외부에 에탄올을 포화 상태로 뿌리고 여분의 에탄올을 털어냅니다. 마이크로트레이를 멸균하려면 플레이트와 뚜껑을 UV 가교제에 별도로 놓습니다. 20 분 후 접시와 뚜껑을 뒤집습니다.
다음으로, 팔미트산 작동 용액이 담긴 15밀리리터 원추형 바이알을 비드 배스에 넣고 사용하기 전에 눈에 보이는 결정이 완전히 용해되도록 합니다. Microtray를 뚜껑이 닫힌 상태에서 비드 수조를 둘러싼 선반에 놓고 2분 동안 예열합니다. 마이크로트레이 뚜껑을 제거하고 마이크로트레이 후면 벽에 200마이크로리터의 팔미트산 작업 용액을 천천히 추가합니다.
뚜껑을 다시 끼우고 마이크로트레이를 비드 수조에 2-3분 동안 그대로 두어 팔미트산 용액이 마이크로트레이 바닥에 가라앉도록 합니다. 마이크로트레이를 180도 회전하고 앞에서 설명한 대로 팔미트산 용액을 추가합니다. 원고에 설명된 구성 요소를 추가하여 lmNGM을 준비합니다.
그런 다음 벤치에 놓인 각 마이크로트레이에 20마이크로리터의 lmNGM을 피펫팅합니다. 오염을 최소화하기 위해 피펫을 리필할 때 마이크로트레이를 덮어야 합니다. 마이크로트레이 웰에 박테리아 식품을 파종하기 위해, 3, 500 G에서 20분 동안 밤새 성장한 배양물을 원심분리한다.
상청액을 제거하고 85 밀리몰 염화나트륨 용액으로 10 배 농도로 박테리아 배양을 재현탁합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 10배 농축 박테리아 배양액을 각 웰의 lmNGM 표면에 조심스럽게 피펫합니다. 박테리아 배양액이 우물 옆을 지나 팔미트산으로 흘러 들어가면 벌레가 우물을 떠나도록 유인할 수 있으므로 피하십시오.
멸균 3D 프린팅 인서트를 멸균 단일 웰 플레이트에 넣습니다. 마이크로트레이를 단일 웰 플레이트의 3D 프린팅 어댑터에 넣습니다. Microtray의 외부 웰과 단일 웰 플레이트의 내부 벽 사이의 3D 프린팅 인서트 위에 물 결정을 자유롭게 분배합니다.
웜이 즉시 추가되지 않으면 다음날 사용할 수 있도록 마이크로트레이를 밀봉하십시오. 트레이 뚜껑을 닫고 Parafilm 한 조각을 사용하여 4면을 모두 감싸 마이크로트레이를 밀봉합니다. Parafilm으로 밀봉 단계를 세 번 더 반복합니다.
원하는 수명 단계에 도달하면 우물당 하나의 벌레를 추가합니다. 단일 웰 플레이트의 뚜껑에 40마이크로리터의 세제 용액을 넣고 작업 물티슈를 사용하여 뚜껑을 고르게 코팅합니다. 추가 작업용 물티슈를 사용하여 뚜껑을 통한 시야가 왜곡되지 않을 때까지 세제 용액을 펴십시오.
Parafilm의 첫 번째 조각을 약간 늘려 트레이의 양면을 덮습니다. 작업 물티슈로 트레이 상단을 닦고 damp 70% 에탄올로 지문을 제거합니다. 접시의 측면이나 상단을 부드럽게 두드리거나 접시에 밝은 파란색 빛을 비추고 각 동물을 관찰하여 수명을 측정합니다.
동물이 몇 초 안에 움직이지 않으면 죽은 점수를 매깁니다. 모든 웜이 죽을 때까지 1-3일마다 이 작업을 반복합니다. 단일 웰에서 형광 이미징을 수행합니다.
황산구리와 디티오트레이톨에 노출되면 벌레의 수명과 건강 기간이 크게 감소했습니다. 대조적으로, 황산구리는 건강에 좋은 삶을 보내는 삶의 비율을 감소시켰지만 디티오트레이톨은 그렇지 않았습니다. 황산구리는 모든 연령대에서 디티오트레이톨보다 인구 내 개인의 평균 활동을 더 많이 감소시켰습니다.
수명 활동 곡선 하에서 개별 동물 영역의 개체군 평균은 황산구리 또는 디티오트레이톨에 의해 실질적으로 손상됩니다. 10일까지 개별 동물의 누적 활성도는 디티오트레이톨 투여 동물의 수명과 상관관계가 있지만, 처리되지 않은 대조군 또는 황산구리 투여 유발 동물의 수명과 상관관계가 있습니다. KYNU-1 발현의 급격한 증가는 성인기 3일에서 8일 사이에 관찰되며, 그 이후에는 나이가 들면서 점진적으로 감소합니다.
성인기 14일째까지 누적된 KYNU-1 mScarlet 발현은 동물의 수명과 상관관계가 있습니다. KYNU-1 발현은 일생 동안 역동적이기 때문에 다양한 연령대의 KYNU-1 발현을 개별 동물의 전체 생존과 비교했습니다. 단일 시점에서 KYNU-1 발현은 생존과 유의미한 상관관계가 없었습니다.
이 절차를 시도할 때 가장 중요한 단계는 팔미트산을 첨가하고, 한천을 피펫팅하고, 벌레를 도입하는 것입니다. 이 기술을 사용하면 NGM 분석과 직접 비교할 수 있는 방식으로 개별 벌레의 형광 바이오마커뿐만 아니라 수명과 건강 기간의 종단 추적이 가능합니다.
