探索两种草药组合策略治疗受损PC12细胞

本研究的方案提供了两种草药治疗缺氧损伤PC12细胞的组合策略，并为优化草药的最佳组合模式提供了参考。该技术可以提供一种简单、可靠、高效的体外实验方法，用于从中草药中筛选有效成分组合，对抗缺氧细胞。该策略也可用于筛选来自其他草药制剂组合的缺氧细胞的组分组合，并阐明其保护机制。

首先，在补充有5%二氧化碳的培养箱中，每两到三天在37摄氏度下传代培养PC12细胞，以获得4至8的传代，用于所有后续实验。用一毫升0.25%胰蛋白酶处理70至80%汇合的PC12细胞，并在显微镜下观察细胞以进行细胞分离。然后通过加入三毫升完整培养基来停止胰蛋白酶消化。

在15毫升离心管中以840×g离心转移细胞旋转五分钟。弃去上清液后，用完整的培养基重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移到1.5毫升微量离心管中。要计数细胞，请启动流式细胞术软件并在计数设置中选择细胞溶液的相应稀释倍数。

加载细胞样本后单击密度图。将细胞群绕出远离 x 轴和 y 轴的圈子。右键单击图下方的数据表，然后选择 X、Y、计数和 Abs。

计数以获得Abs.Count数据表下的细胞计数结果。用完全培养基将细胞浓度调节至每毫升约1乘以10至第5个细胞后，将每孔100微升细胞悬液加入96孔板中，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。第二天，向上清液丢弃的平板中加入120微升每毫升MTT溶液120微升，并在37摄氏度下孵育4小时。

孵育后，弃去上清液后，向每个孔中加入150微升DMSO。将板在涡旋振荡器中以每分钟 240 次的速度振荡 10 分钟。然后在酶标仪中测量490纳米处的吸光度。

为了通过均质设计方法筛选药物的最佳组合，如前所述培养细胞，并用六种不同比例浓度的黄芪注射液和短囊治疗受伤的PC12细胞。为了评估两种最佳组合的保护作用，用两种类型的药物组合治疗受伤的PC12细胞。如前所述，孵育细胞24小时并计算细胞活力。

将PC12细胞接种在12孔板中，并在37摄氏度下孵育24小时。药物治疗后，每孔用250微升胰蛋白酶处理细胞，并在室温下以840×g离心细胞5分钟。然后用500微升结合缓冲液重悬细胞沉淀。

每组加入5微升膜联蛋白V-FITC和10微升碘化丙啶，一式三份，并在室温下在黑暗中孵育细胞15分钟，以使用流式细胞术检查细胞凋亡。在流式细胞仪软件中，单击"开始"菜单中的"自动补偿"，在"选择通道"中选择"FITC、PE"、"PerCP"和"APC"，然后选择"高空补偿"。然后在统计项目:中值中单击确定。

单击密度图并使用前面演示的细胞计数方法圈出有效细胞群。使用 FITC 荧光作为 x 轴参数，将其他荧光作为 y 轴参数，创建密度图。单击"开始"菜单中的"补偿矩阵"和"溢出矩阵中的系数"。

将PC12细胞接种到盖玻片上，一式三份放置在24孔板孔上，并在37摄氏度下孵育24小时。药物治疗后，用PBS冲洗盖玻片两次，每次5分钟，用4%多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用0.5%Triton X-100透化20分钟。冲洗细胞后，在室温下用10%山羊血清封闭一小时。

向每个盖玻片中加入200微升稀释的一抗半胱天冬酶-3，并在4摄氏度下孵育过夜。第二天，用TBST缓冲液洗涤三次，每次三分钟，并在室温下在黑暗中与200微升二抗孵育一小时。孵育后，用300微升每毫升0.5微克DAPI孵育盖玻片10分钟，并用TBST洗涤细胞三次，每次5分钟。

在荧光显微镜下捕获盖玻片图像，并使用成像软件统计分析荧光强度。用PBS洗涤药物治疗的PC12细胞盖玻片三次，每次三分钟，并与400微升10微摩尔二氯二氢荧光素二乙酸酯在37摄氏度下孵育20分钟。用无血清DMEM再次洗涤细胞两次，每次三分钟。

加入荧光淬灭剂，立即在荧光显微镜下捕获盖玻片图像，用成像软件计算相对荧光强度。用PBS在6孔板中洗涤药物治疗的PC12细胞三次，每次5分钟，并在每孔100微升的制备裂解缓冲液中在冰上孵育30分钟。裂解后，将细胞在4摄氏度下以16， 000×g离心20分钟以收集上清液。

通过Bradford测定法检测蛋白质浓度后，在每个泳道中用25微克蛋白质运行12%SDS-PAGE电泳，并将凝胶转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜1.5小时，并在4摄氏度下与5毫升相应的一抗孵育24小时。用TBST孵育和洗涤膜三次后，每次10分钟，在室温下与5毫升二级HRP偶联抗体孵育2小时。

最后，在TBST洗涤的膜上，按照制造商的说明加入化学发光HRP底物进行蛋白质条带检测。然后使用化学发光成像系统捕获图像，以β-肌动蛋白作为内部对照来量化蛋白质的灰度值。使用黄芪注射液时，正常PC12细胞的细胞活力低于95%，浓度大于12微摩尔，短囊大于5微摩尔。

黄芪注射液可提高6-12微摩尔浓度范围内损伤PC12细胞的存活率，2-5微摩尔浓度范围内的短囊可提高存活率。而比例为6至1.8微摩尔的药物组合表现出最高的细胞活力。两种组合对损伤PC12细胞的细胞活力得到显著提升，且组分组合优于制备组合。

细胞凋亡率显示，模型组早凋亡细胞、晚期细胞和总凋亡细胞的百分比显著高于正常组。与模型组相比，治疗组各分期凋亡细胞百分比显著降低。与模型组相比，各处理组半胱天冬酶-3的荧光强度显著降低，组分组合组的荧光强度相对较低。

基因Akt、Bcl-2和Bax的相对表达表明，组分组合在促进细胞存活方面优于制剂组合，这与更强的抗细胞凋亡作用有关。与制剂组合相比，组分组合表现出更好的抗氧化损伤效果，Nrf2蛋白的表达显著提高。该方法可用于筛选和评估成分组合与草药组合中的其他潜在药理活性，例如抗炎，抗菌等。