该方法提供了一种从同一只小鼠的特定卵巢细胞群中分离核酸的技术，而无需细胞分选。该技术可以帮助确定特定细胞群在各种条件下的变化。例如，随着年龄的增长。
该技术的主要优点是它允许对特定卵巢细胞类型进行配对的表观基因组和转录组学分析，而无需细胞分选。这显著提高了通量，降低了成本，并且在对卵巢组织进行细胞类型特异性分析时无需专用设备。在这里，我们的目标是确定生殖衰老前卵巢衰老发生的细胞类型特异性变化，这对治疗女性不孕症具有意义。
该方法可以应用于身体系统中的任何细胞类型，其中有细胞类型特异性的Cre驱动程序可用。该技术最困难的部分是为您感兴趣的细胞类型选择合适的Cre系。建议对细胞特异性进行广泛验证。
首先，在500微升细胞核裂解缓冲液中从安乐死小鼠中收集一个卵巢，并使用自开式微型剪刀将卵巢切成缓冲液内的八部分。将切碎的卵巢和裂解缓冲液转移到冰上的玻璃弹跳均质器中，并用松散的杵A均质卵巢10至20次.向dounce均质器洗涤杵A中加入400微升裂解缓冲液.然后用紧密的杵B均质卵巢10至20次。将匀浆转移到两毫升圆底管中，并在 4 摄氏度下以 200 g 离心 1.5 分钟，以去除未解离的组织和血管。
用100微升裂解缓冲液预润湿30微米细胞过滤器后，通过过滤器将上清液过滤到15毫升锥形管中。将含有混合物的细胞核转移到两毫升圆底管中。将样品在 500 g 下在 4 摄氏度下离心五分钟，然后弃去上清液。
通过中高速短暂涡旋，将细胞核沉淀重悬于250微升冰冷裂解缓冲液中。通过添加 1.5 毫升裂解缓冲液使体积达到 1.75 毫升。轻轻混合并将细胞核悬浮液在冰上休息五分钟。
通过在 500 g 下在 4 摄氏度下离心五分钟来沉淀细胞核。并小心地丢弃上清液而不干扰细胞核沉淀。将沉淀重悬于200微升冰冷储存缓冲液中，并短暂涡旋以完全重悬细胞核沉淀。
保留 10% 的重悬沉淀作为下游分析的输入细胞核样品。取重悬的细胞核托盘，用冰冷的核纯化缓冲液或NPB将体积补足至两毫升。将每个样品的重悬珠子加入 30 微升到两毫升圆底管中。
然后加入一毫升NPB，并通过移液重悬良好。将试管放在磁性架上一分钟以分离珠子。弃去上清液并从磁铁上取出管。
将洗涤过的磁珠重悬于一毫升NPB中。重复洗涤步骤，总共洗涤三次。最后一次洗涤后，将珠子重新悬浮在NPB的初始体积中。
将30微升洗涤的珠子加入两毫升核悬浮液中，并通过移液并轻轻倒置管将珠子核混合物重悬良好。将试管低速放置在冷藏室或冰箱中的旋转混合器上30分钟，并在相同条件下孵育没有珠子的输入样品。将带有细胞核悬浮液和珠子的管放在磁铁上三分钟，以将与链霉亲和素珠结合的生物素化细胞核与细胞核的负部分分开。
除去上清液。将负部分传递到新鲜的两毫升管中，并将其保存在冰上。对于每个正馏分管，将管从磁铁上取下并将内容物重悬于一毫升NPB中。
将管放在磁铁上一分钟，然后弃去上清液。将正馏分珠核混合物重悬于30微升NPB中。将卵巢和100微升均质缓冲液转移到玻璃弹跳均质器中，并用松散的杵A均质10至20次.向洗涤杵A中加入400微升TRAP均质缓冲液，并将匀浆转移到两毫升圆底管中。
用另外一毫升TRAP均质缓冲液洗涤均质器，并将洗涤的体积转移到两毫升圆底管中。将匀浆在12， 000g下在4摄氏度下离心10分钟。并将澄清的上清液转移到新鲜的两毫升圆底管中。
丢弃颗粒后，将100微升清除的匀浆转移到新鲜的两毫升圆底管中，并将其保留为冰上的输入。将剩余的清除匀浆与每毫升 5 微克抗 GFP 抗体在 4 摄氏度下孵育一小时，同时在端到端混合器中旋转。在相同条件下孵育输入样品。
将每个样品的50微升蛋白质G磁珠转移到两毫升圆底管中。向珠子中加入 500 微升低盐洗涤缓冲液，轻轻移液混合。将试管放入磁性支架中一分钟，以将珠子收集到管的侧面。
弃去上清液后，从磁性支架上取出试管，并向试管中加入一毫升低盐洗涤缓冲液。轻轻移液混合。再次，将管子放入磁性支架并重复该步骤，总共洗涤三次。
最后一次洗涤后，将珠子重悬于初始体积的低盐洗涤缓冲液中。将重悬的洗涤珠转移到抗原样品抗体混合物中，并在 4 摄氏度下孵育过夜，同时在端到端混合器中旋转。将输入样品在同等条件下孵育过夜。
之后，使用磁性支架将正级分或带有目标核糖体RNA的磁珠与负级分或上清液分离2.5至3分钟。吸出负部分。将其放入新鲜的两毫升圆底管中，放在冰上。
将500微升高盐洗涤缓冲液加入含有正级分的管中，轻轻移液混合。将试管放在冰上保持一分钟的磁性支架上以分离珠子。弃去上清液后，从磁铁上取下管并重复该步骤，总共洗涤三次。
最后一次洗涤后，将磁珠重悬于补充有3.5微升2-巯基乙醇的350微升RNA裂解缓冲液中。在室温下孵育试管，同时在数字摇床中以 900 RPM 混合 10 分钟。在室温下用磁性支架将珠子从现在含有目标核糖体RNA的溶液中分离一分钟。
将洗脱的正级分收集在新鲜的1.5毫升管中。对Cyp17-Cre阳性NuTRAP絮凝物和Cyp17-Cre阴性NuTRAP絮凝物小鼠的石蜡卵巢进行免疫荧光成像。EGFP蛋白采用山羊抗GFP一抗和Alexa 488驴抗山羊二抗染色，细胞核用DAPI染色。
在荧光显微镜上以20倍放大倍率拍摄图像。从Cyp17-Cre阳性NuTRAP小鼠卵巢中分离输入和TRAP阳性部分RNA，并以配对的末端方式测序。所有表达基因的主成分分析显示，TRAP输入和第一组分中的正组分分离。
此处显示了输入部分和正分数之间差异表达基因的火山图。TRAP阳性部分与输入的比较显示，TRAP阳性部分的基质/膜细胞标志基因总体富集，卵母细胞、颗粒、免疫和平滑肌细胞标记基因的消耗。在核悬浮液的第一次离心以除去未解离的血管后，细胞核在上清液中。
确保此时保留上清液并丢弃沉淀。按照完整方法，可以进行几种表观基因组技术，包括染色质可及性或DNA修饰等测定。按照TRAP方法，可以进行RT-qCPR或RNA测序以评估翻译组。
这是NuTRAP方法在小鼠卵巢中的首次应用。这允许对特定卵巢细胞类型进行高通量表观基因组和转录组学分析，可用于研究卵巢衰老或癌症。
