Bu yöntem, hücre sıralamaya gerek kalmadan nükleik asitleri belirli yumurtalık hücre popülasyonlarından aynı fareden izole etmek için bir teknik sağlar. Bu teknik, spesifik hücre popülasyonlarının çeşitli koşullar altında nasıl değiştiğini belirlemeye yardımcı olabilir. Örneğin, yaşlanma ile.
Bu tekniğin temel avantajı, hücre sıralamasına gerek kalmadan belirli bir yumurtalık hücre tipinden eşleştirilmiş epigenomik ve transkriptomik analize izin vermesidir. Bu, verimi önemli ölçüde artırır, maliyeti düşürür ve yumurtalık dokusundan hücre tipine özgü analiz yaparken özel ekipman ihtiyacını ortadan kaldırır. Burada amacımız, kadın infertilitesinin tedavisinde etkileri olan üreme yaşlanmasından önce yumurtalık yaşlanması ile ortaya çıkan hücre tipine özgü değişiklikleri tanımlamaktır.
Bu yöntem, hücre tipine özgü Cre sürücüsünün mevcut olduğu vücut sistemlerindeki herhangi bir hücre tipine uygulanabilir. Bu tekniğin en zor kısmı, ilgilendiğiniz hücre tipi için uygun bir Cre hattı seçmektir. Hücre özgüllüğünün kapsamlı bir şekilde doğrulanması önerilir.
Başlamak için, ötenazi fareden 500 mikrolitre çekirdek lizis tamponunda bir yumurtalık toplayın ve kendiliğinden açılan mikro makas kullanarak yumurtalıkları tampon içinde sekiz parçaya bölün. Kıyılmış yumurtalık ve lizis tamponunu buz üzerinde bir cam sıçrama homojenizatörüne aktarın ve yumurtalığı gevşek havaneli A.Sıçrama homojenizatörü yıkama havanesine 400 mikrolitre lizis tamponu ekleyin A.Ve ardından yumurtalığı sıkı havane B ile 10 ila 20 kez homojenize edin. Homojenatı iki mililitrelik yuvarlak bir alt tüpe aktarın ve ayrılmamış doku ve kan damarlarını çıkarmak için dört santigrat derecede 1,5 dakika boyunca 200 g'da santrifüj.
30 mikrometrelik bir hücre süzgecini 100 mikrolitre lizis tamponu ile önceden ıslattıktan sonra, süpernatantı süzgeçten 15 mililitrelik bir konik tüpe filtreleyin. Karışımı içeren çekirdekleri iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Çekirdek peletini 250 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponunda, orta ila yüksek hızda kısa bir süre vorteks yaparak yeniden askıya alın. 1,5 mililitre lizis tamponu ekleyerek hacmi 1,75 mililitreye çıkarın. Yavaşça karıştırın ve çekirdek süspansiyonunu beş dakika boyunca buz üzerinde dinlendirin.
Çekirdekleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 g'da santrifüjleme yoluyla peletleyin. Ve çekirdek topağını rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın. Çekirdek peletini tamamen yeniden askıya almak için peleti 200 mikrolitre buz soğuk depolama tamponunda ve vorteksinde kısaca askıya alın.
Askıya alınmış peletin %10'unu çıkış yönündeki analiz için giriş çekirdeği numunesi olarak ayırın. Askıya alınmış çekirdek paletini alın ve buz gibi soğuk nükleer arıtma tamponu veya NPB ile hacmi iki mililitreye çıkarın. Her numune için iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe 30 mikrolitre yeniden askıya alınmış boncuk ekleyin.
Ardından bir mililitre NPB ekleyin ve pipetleme ile iyice askıya alın. Boncukları ayırmak için tüpü manyetik rafa bir dakika boyunca yerleştirin. Süpernatantı atın ve tüpü mıknatıstan çıkarın.
Yıkanmış manyetik boncukları bir mililitre NPB'de tekrar askıya alın. Toplam üç yıkama için yıkama adımını tekrarlayın. Ve son yıkamadan sonra, boncukları NPB'nin ilk hacminde yeniden askıya alın.
Yıkanmış boncukların 30 mikrolitresini nükleer süspansiyonun iki mililitresine ekleyin ve pipetleyerek ve tüpü yavaşça ters çevirerek boncuk çekirdeği karışımını iyice askıya alın. Tüpleri soğuk bir odada veya buzdolabında düşük hızda 30 dakika boyunca dönen bir karıştırıcıya yerleştirin ve giriş örneklerini aynı koşullarda boncuksuz olarak inkübe edin. Streptavidin boncuklarına bağlı biyotinile çekirdekleri çekirdeklerin negatif fraksiyonundan ayırmak için tüpleri çekirdek süspansiyonu ve boncuklarla mıknatısın üzerine üç dakika boyunca yerleştirin.
Supernatan'ı çıkarın. Negatif fraksiyonu iki mililitrelik taze bir tüpe geçirin ve buz üzerinde saklayın. Her pozitif fraksiyon tüpü için, tüpü mıknatıstan çıkarın ve içeriği bir mililitre NPB'de yeniden askıya alın.
Tüpü mıknatısın üzerine bir dakika boyunca yerleştirin ve süpernatanı atın. Pozitif fraksiyon boncuk çekirdeği karışımını 30 mikrolitre NPB'de tekrar askıya alın. Yumurtalık ve 100 mikrolitre homojenizasyon tamponunu bir cam sıçrama homojenizatörüne aktarın ve gevşek havaneli A.A yıkama havanesine 400 mikrolitre TRAP homojenizasyon tamponu ekleyin ve homojenatı iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
Homojenizatörü ilave bir mililitre TRAP homojenizasyon tamponu ile yıkayın ve yıkanan hacmi iki mililitrelik yuvarlak alt boruya aktarın. Homojenatı 12.000 g'da dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin. Ve temizlenmiş süpernatantı yeni iki mililitrelik yuvarlak bir alt tüpe aktarın.
Pelet atıldıktan sonra, temizlenmiş homojenatın 100 mikrolitresini yeni iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın ve buz üzerine girdi olarak ayırın. Temizlenmiş homojenatın geri kalanını, bir uçtan uca karıştırıcıda dönerken, mililitre anti-GFP antikoru başına beş mikrogram ile dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Giriş örneğini aynı durumda inkübe edin.
Her numune için 50 mikrolitre protein G manyetik boncuklarını iki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Boncuklara 500 mikrolitre düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve karıştırmak için yavaşça pipet yapın. Boncukları tüpün yan tarafına doğru toplamak için tüpü bir dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin.
Süpernatanı attıktan sonra, tüpü manyetik standdan çıkarın ve tüpe bir mililitre düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Karıştırmak için yavaşça pipet yapın. Yine, tüpü manyetik standın içine yerleştirin ve toplam üç yıkama için adımı tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, boncukları düşük tuzlu yıkama tamponunun ilk hacminde tekrar askıya alın. Yeniden askıya alınmış yıkanmış boncukları antijen numunesi antikor karışımına aktarın ve uçtan uca bir karıştırıcıda dönerken gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Giriş örneklerini eşdeğer koşullarda bir gecede inkübe edin.
Bundan sonra, pozitif fraksiyonu veya manyetik boncukları hedef ribozomlar RNA ile negatif fraksiyondan veya süpernatanttan manyetik standı kullanarak 2.5 ila 3 dakika ayırın. Negatif fraksiyonu aspire edin. İki mililitrelik taze bir yuvarlak alt tüpe yerleştirin ve buzun üzerine koyun.
Pozitif fraksiyonlu tüpe 500 mikrolitre yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipet yapın. Boncukları ayırmak için tüpü bir dakika boyunca buz üzerinde tutulan manyetik bir standın üzerine yerleştirin. Süpernatanı attıktan sonra, tüpü mıknatıstan çıkarın ve toplam üç yıkama için adımı tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, boncukları 3.5 mikrolitre 2-merkaptoetanol ile desteklenmiş 350 mikrolitre RNA lizis tamponunda yeniden askıya alın. Dijital bir çalkalayıcıda 900 RPM'de 10 dakika karıştırırken tüpleri oda sıcaklığında inkübe edin. Boncukları, şimdi hedef ribozomlar RNA'yı içeren çözeltiden, oda sıcaklığında bir dakika boyunca manyetik bir stand ile ayırın.
Salınan pozitif fraksiyonu taze 1,5 mililitrelik bir tüpte toplayın. İmmünofloresan görüntüleme, Cyp17-Cre pozitif NuTRAP floks ve Cyp17-Cre negatif NuTRAP floks farelerin parafinize yumurtalıklarında yapıldı. EGFP proteini keçi anti-GFP primer antikoru ve Alexa 488 eşek anti-keçi sekonder antikoru kullanılarak boyandı ve çekirdekler DAPI ile boyandı.
Görüntüler floresan mikroskobunda 20x büyütmede çekildi. Giriş ve TRAP pozitif fraksiyon RNA'sı, Cyp17-Cre pozitif NuTRAP floks fare yumurtalıklarından izole edildi ve eşleştirilmiş bir son şekilde sıralandı. İfade edilen tüm genlerin ana bileşen analizi, ilk bileşendeki TRAP girişinin ve pozitif fraksiyonların ayrıldığını gösterdi.
Giriş ve pozitif fraksiyonlar arasındaki farklı şekilde eksprese edilen genlerin volkan grafiği burada gösterilmiştir. TRAP pozitif fraksiyonunun girdi ile karşılaştırılması, stroma / theca hücre belirteci genlerinin genel olarak zenginleşmesini ve TRAP pozitif fraksiyonundaki oosit, granüloza, immün ve düz kas hücresi belirteci genlerinin tükenmesini göstermiştir. Ayrışmamış kan damarlarını çıkarmak için nükleer süspansiyonun ilk santrifüjlenmesinden sonra, çekirdekler süpernatanttadır.
Süpernatantı tuttuğunuzdan ve peleti bu noktada attığınızdan emin olun. Bozulmamış yöntemi takiben, kromatin erişilebilirliği veya diğerleri arasında DNA modifikasyonları için testler de dahil olmak üzere çeşitli epigenomik teknikler uygulanabilir. TRAP yöntemini takiben, translatomu değerlendirmek için RT-qCPR veya RNA dizilimi yapılabilir.
Bu, NuTRAP yönteminin fare yumurtalıklarındaki ilk uygulamasıdır. Bu, yumurtalık yaşlanmasını veya kanserini incelemek için kullanılabilecek spesifik yumurtalık hücre tiplerinden yüksek verimli epigenomik ve transkriptomik analizlere izin verir.
