이 방법은 세포 분류를 할 필요 없이 동일한 마우스로부터 특정 난소 세포 집단으로부터 핵산을 분리하는 기술을 제공한다. 이 기술은 다양한 조건에서 특정 세포 집단이 어떻게 변화하는지 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 노화.
이 기술의 주요 장점은 세포 분류 없이 특정 난소 세포 유형에서 쌍을 이루는 후성유전체학 및 전사체 분석을 허용한다는 것입니다. 이는 처리량을 크게 증가시키고 비용을 줄이며 난소 조직에서 세포 유형별 분석을 수행할 때 특수 장비가 필요하지 않습니다. 여기에서 우리의 목표는 여성 불임 치료에 영향을 미치는 생식 노화 이전에 난소 노화와 함께 발생하는 세포 유형별 변화를 확인하는 것입니다.
이 방법은 세포 유형별 Cre 드라이버를 사용할 수 있는 신체 시스템 전반에 걸쳐 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 이 기술에서 가장 어려운 부분은 관심 있는 세포 유형에 적합한 Cre 라인을 선택하는 것입니다. 세포 특이성의 광범위한 검증이 권장됩니다.
시작하려면 안락사 된 마우스에서 500 마이크로 리터의 핵 용해 완충액에서 난소 하나를 수집하고 자체 개방 마이크로 가위를 사용하여 완충액 내에서 난소를 8 부분으로 자릅니다. 다진 난소와 용해 완충액을 얼음에 유리 균질화기로 옮기고 느슨한 유봉 A.Add 용질 완충액으로 난소를 10-20회 균질화합니다. 균질액을 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 1.5 분 동안 200g에서 원심 분리하여 해리되지 않은 조직과 혈관을 제거한다.
100 마이크로리터의 용해 완충액으로 30 마이크로미터 셀 스트레이너를 사전 습윤시킨 후, 스트레이너를 통해 상청액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과한다. 혼합물을 함유하는 핵을 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮긴다. 섭씨 4도에서 5분 동안 500g에서 샘플을 원심분리하고 상층액을 버립니다.
250마이크로리터의 얼음처럼 차가운 용해 완충액에 핵 펠릿을 중등도에서 고속으로 잠시 볼텍싱하여 재현탁합니다. 1.5 밀리리터의 용해 완충액을 추가하여 부피를 최대 1.75 밀리리터까지 가져옵니다. 부드럽게 섞고 핵 현탁액을 5 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
섭씨 4도에서 5분 동안 500g에서 원심분리하여 핵을 펠릿화합니다. 그리고 핵 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 버립니다. 펠릿을 200마이크로리터의 얼음 냉장 보관 완충액에 재현탁하고 잠시 소용돌이하여 핵 펠릿을 완전히 재현탁합니다.
재현탁 펠릿의 10%를 다운스트림 분석을 위한 입력 핵 샘플로 예약합니다. 재현 탁 된 핵 팔레트를 가져 와서 얼음처럼 차가운 핵 정화 완충액 (NPB)으로 부피를 2 밀리리터로 구성하십시오. 각 샘플에 대해 30마이크로리터의 재현탁 비드를 2밀리리터 원형 바닥 튜브에 추가합니다.
그런 다음 1 밀리리터의 NPB를 추가하고 피펫 팅으로 잘 재현 탁하십시오. 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 올려 놓고 비드를 분리합니다. 상층액을 버리고 자석에서 튜브를 제거합니다.
세척된 마그네틱 비드를 1밀리리터의 NPB에 재현탁합니다. 총 세 번의 세척 단계를 반복합니다. 그리고 최종 세척 후, NPB의 초기 부피에서 비드를 다시 현탁하십시오.
세척된 비드 30마이크로리터를 2밀리리터의 핵 현탁액에 첨가하고 튜브를 피펫팅하고 부드럽게 뒤집어 비드 핵 혼합물을 잘 재현탁합니다. 튜브를 냉장실이나 냉장고의 회전 믹서에 저속으로 30분 동안 놓고 동일한 조건에서 비드 없이 입력 샘플을 배양합니다. 핵 현탁액과 비드가 있는 튜브를 자석에 3분 동안 놓아 스트렙타비딘 비드에 결합된 비오티닐화 핵을 핵의 음성 분획에서 분리합니다.
상청액을 제거합니다. 음수 분수를 신선한 2 밀리리터 튜브에 통과시키고 얼음 위에 보관하십시오. 각 양성 분획 튜브에 대해 자석에서 튜브를 제거하고 1 밀리리터의 NPB에 내용물을 다시 현탁합니다.
튜브를 자석에 1분 동안 놓고 상층액을 버립니다. 양성 분획 비드 핵 혼합물을 30 마이크로리터의 NPB에 재현탁시킨다. 난소와 100 마이크로 리터의 균질화 완충액을 유리 dounce 균질 화기로 옮기고 느슨한 유봉 A.Add 400 마이크로 리터의 TRAP 균질화 완충액을 세척 유봉 A에 넣고 균질 액을 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
추가의 1 밀리리터의 TRAP 균질화 완충액으로 균질기를 세척하고, 세척된 부피를 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮긴다. 균질액을 섭씨 4도에서 10분 동안 12, 000g에서 원심분리한다. 그리고 깨끗해진 상청액을 새로운 2밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
펠릿을 버린 후, 100 마이크로 리터의 제거 된 균질 액을 새로운 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮기고 얼음에 입력으로 남겨 둡니다. 투명해진 균질액의 나머지 부분을 밀리리터당 5마이크로그램의 항-GFP 항체와 함께 섭씨 4도에서 1시간 동안 종단 믹서에서 회전시키면서 배양합니다. 동일한 조건에서 입력 샘플을 배양합니다.
각 샘플에 대해 50 마이크로리터의 단백질 G 마그네틱 비드를 2밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 500마이크로리터의 저염 세척 버퍼를 비드에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 놓아 튜브 측면에 비드를 모읍니다.
상층액을 버린 후 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 1밀리리터의 저염 세척 버퍼를 튜브에 추가합니다. 부드럽게 섞이도록 피펫으로 만듭니다. 다시 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 총 3회 세척 단계를 반복합니다.
최종 세척 후, 저염 세척 완충액의 초기 부피에 비드를 재현탁합니다. 재현탁된 세척된 비드를 항원 샘플 항체 혼합물로 옮기고 엔드 오버 엔드 믹서에서 회전하면서 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션합니다. 동일한 조건에서 하룻밤 동안 입력 샘플을 배양합니다.
그 후, 2.5 내지 3분 동안 마그네틱 스탠드를 사용하여 음성 분획 또는 상층액으로부터 표적 리보솜 RNA와 함께 양성 분획 또는 자성 비드를 분리한다. 음수 분획을 흡인합니다. 신선한 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브에 넣고 얼음 위에 따로 보관하십시오.
500마이크로리터의 고염분 세척 버퍼를 양성 분획과 함께 튜브에 넣고 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 튜브를 얼음 위에 1분 동안 유지된 마그네틱 스탠드에 올려 놓아 비드를 분리합니다. 상층액을 버린 후 자석에서 튜브를 제거하고 총 3회 세척 단계를 반복합니다.
최종 세척 후, 3.5 마이크로리터의 2-메르캅토에탄올로 보충된 350 마이크로리터의 RNA 용해 완충액에 비드를 재현탁시킨다. 디지털 셰이커에서 900RPM으로 10분 동안 혼합하면서 실온에서 튜브를 배양합니다. 표적 리보솜 RNA를 포함하는 용액에서 비드를 실온에서 1분 동안 자기 스탠드로 분리합니다.
용출된 양성 분획을 새로운 1.5밀리리터 튜브에 수집합니다. Cyp17-Cre 양성 NuTRAP flox 및 Cyp17-Cre 음성 NuTRAP flox 마우스의 파라핀화된 난소에서 면역형광 이미징을 수행했습니다. EGFP 단백질은 염소 항-GFP 1차 항체와 Alexa 488 당나귀 항염소 2차 항체를 이용하여 염색하였고, 핵은 DAPI로 염색하였다.
이미지는 형광 현미경으로 20x 배율로 촬영되었습니다. 입력 및 TRAP 양성 분획 RNA를 Cyp17-Cre 양성 NuTRAP 플록스 마우스 난소에서 분리하고 쌍을 이루는 말단 방식으로 시퀀싱했습니다. 발현된 모든 유전자의 주성분 분석은 제1 성분에서 TRAP 입력과 양성 분획의 분리를 보여주었다.
입력 분획과 양성 분획 사이에 차등적으로 발현된 유전자의 화산 플롯이 여기에 표시됩니다. 입력에 대한 TRAP 양성 분획의 비교는 TRAP 양성 분획에서 간질/세카 세포 마커 유전자의 전반적인 농축과 난모세포, 과립구, 면역 및 평활근 세포 마커 유전자의 고갈을 보여주었습니다. 해리되지 않은 혈관을 제거하기 위해 핵 현탁액의 첫 번째 원심 분리 후, 핵은 상청액에 있습니다.
이 시점에서 상층액을 유지하고 펠릿을 폐기하십시오. 온전한 방법에 따라 염색질 접근성 또는 DNA 변형에 대한 분석을 포함하여 여러 후성유전체 기술을 수행할 수 있습니다. TRAP 방법에 따라 RT-qCPR 또는 RNA 시퀀싱을 수행하여 번역체를 평가할 수 있습니다.
이것은 마우스 난소에서 NuTRAP 방법의 첫 번째 적용입니다. 이를 통해 특정 난소 세포 유형에서 고처리량 후성유전체학 및 전사체 분석이 가능하며, 이는 난소 노화 또는 암을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.
