この方法は、細胞ソーティングを必要とせずに、同じマウスの特定の卵巣細胞集団から核酸を単離する技術を提供します。この手法は、特定の細胞集団がさまざまな条件下でどのように変化しているかを特定するのに役立ちます。たとえば、加齢とともに。
この技術の主な利点は、細胞選別を必要とせずに、特定の卵巣細胞型からのエピゲノム解析とトランスクリプトーム解析のペアを可能にすることです。これにより、スループットが大幅に向上し、コストが削減され、卵巣組織から細胞種特異的分析を実行する際に特殊な機器が不要になります。ここでの目標は、生殖老化前の卵巣老化に伴って起こる細胞型特異的変化を特定することであり、これは女性の不妊症の治療に影響を及ぼします。
この方法は、細胞型固有のCreドライバーが利用可能な身体システム全体の任意の細胞型に適用できます。この手法の最も難しい部分は、目的の細胞タイプに適したCreラインを選択することです。細胞特異性の広範な検証が推奨されます。
まず、安楽死させたマウスから500マイクロリットルの核溶解バッファーで卵巣を1つ採取し、自己開口マイクロハサミを使用してバッファー内の卵巣を8つの部分に切り刻みます。ミンチ卵巣と溶解バッファーを氷上のガラスダウンスホモジナイザーに移し、緩い乳棒で卵巣を10〜20回ホモジナイズしますA.400マイクロリットルの溶解バッファーをダウンスホモジナイザー洗浄乳棒Aに追加し、次に卵巣をタイトな乳棒Bで10〜20回ホモジナイズします。ホモジネートを2ミリリットルの丸底チューブに移し、200gで摂氏4度で1.5分間遠心分離して、解離していない組織と血管を取り除きます。
30マイクロメートルのセルストレーナーを100マイクロリットルの溶解バッファーで事前に濡らした後、上清をストレーナーを通して15ミリリットルのコニカルチューブにろ過します。核含有混合物を2ミリリットルの丸底管に移す。サンプルを摂氏4度で5分間500gで遠心分離し、上清を廃棄します。
核ペレットを250マイクロリットルの氷冷溶解バッファーに再懸濁し、中程度から高速で短時間ボルテックスします。1.5ミリリットルの溶解バッファーを加えて、容量を1.75ミリリットルまで上げます。穏やかに混合し、核懸濁液を氷上に5分間置く。
500 gで4°Cで5分間遠心分離して核をペレット化します。そして核ペレットを乱すことなく上澄み液を慎重に捨てる。ペレットを200マイクロリットルの氷冷貯蔵バッファーに再懸濁し、短時間ボルテックスして核ペレットを完全に再懸濁します。
再懸濁したペレットの10%を下流分析用の入力核サンプルとして予約します。再懸濁した核パレットを取り、氷冷核浄化バッファー(NPB)で容量を2ミリリットルに補います。各サンプルに対して30マイクロリットルの再懸濁ビーズを2ミリリットルの丸底チューブに加えます。
その後、1ミリリットルのNPBを加え、ピペッティングでよく再懸濁します。チューブを磁気ラックに1分間置き、ビーズを分離します。上澄み液を廃棄し、磁石からチューブを取り外します。
洗浄した磁気ビーズを1ミリリットルのNPBに再懸濁します。洗浄手順を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。そして最後の洗浄の後、NPBの初期容量でビーズを再懸濁します。
30マイクロリットルの洗浄ビーズを2ミリリットルの核懸濁液に加え、チューブをピペッティングして穏やかに反転させることにより、ビーズ核混合物をよく再懸濁します。チューブを冷蔵室または冷蔵庫の回転ミキサーに低速で30分間置き、同じ条件でビーズなしでインキュベートします。核懸濁液とビーズを入れたチューブを磁石の上に3分間置き、ストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化核を核の負の部分から分離します。
上清を取り除きます。負の割合を新しい2ミリリットルのチューブに渡し、氷の上に保存します。正のフラクションチューブごとに、チューブを磁石から取り外し、内容物を1ミリリットルのNPBに再懸濁します。
チューブを磁石の上に1分間置き、上清を捨てます。ポジティブフラクションビーズ核混合物を30マイクロリットルのNPBに再懸濁します。卵巣と100マイクロリットルのホモジナイザーをガラスダウンスホモジナイザーに移し、緩い乳棒Aで10〜20回ホモジナイズします.400マイクロリットルのTRAPホモジナイズバッファーを洗浄乳棒Aに追加し、ホモジネートを2ミリリットルの丸底チューブに移します。
追加の1ミリリットルのTRAPホモジナイゼーションバッファーでホモジナイザーを洗浄し、洗浄した量を2ミリリットルの丸底チューブに移します。ホモジネートを12, 000 gで摂氏4度で10分間遠心分離します。そして、透明にした上清を新鮮な2ミリリットルの丸底チューブに移します。
ペレットを廃棄した後、100マイクロリットルの透明なホモジネートを新しい2ミリリットルの丸い底のチューブに移し、氷上の入力として保存します。透明化した残りのホモジネートを、1ミリリットルあたり5マイクログラムの抗GFP抗体とともに、エンドオーバーエンドミキサーで回転させながら摂氏4度で1時間インキュベートします。同じ条件でインプットサンプルをインキュベートします。
各サンプルの50マイクロリットルのプロテインG磁気ビーズを2ミリリットルの丸底チューブに移します。500マイクロリットルの減塩洗浄バッファーをビーズに加え、ピペットで穏やかに混合します。チューブを磁気スタンドに1分間置き、チューブの側面にビーズを集めます。
上清を廃棄した後、チューブを磁気スタンドから取り外し、1ミリリットルの減塩洗浄バッファーをチューブに追加します。ピペットでやさしく混ぜます。もう一度、チューブを磁気スタンドに入れ、合計3回の洗浄で手順を繰り返します。
最終洗浄後、ビーズを低塩洗浄バッファーの初期容量に再懸濁します。再懸濁した洗浄ビーズを抗原サンプル抗体混合物に移し、エンドオーバーエンドミキサーで回転させながら摂氏4度で一晩インキュベートします。入力サンプルを同等の条件で一晩インキュベートします。
その後、磁気スタンドを用いて2.5〜3分間、陰性画分または上清から標的リボソームRNAを有する陽性画分または磁気ビーズを分離する。負の分数を吸引します。それを新鮮な2ミリリットルの丸い底のチューブに入れ、氷の上に置いておきます。
500マイクロリットルの高塩分洗浄バッファーをポジティブ画分とともにチューブに加え、穏やかにピペットで混合します。氷上に維持された磁気スタンドにチューブを1分間置き、ビーズを分離します。上清を廃棄した後、チューブを磁石から取り外し、合計3回の洗浄のために手順を繰り返します。
最終洗浄後、3.5マイクロリットルの2-メルカプトエタノールを添加した350マイクロリットルのRNA溶解バッファーにビーズを再懸濁します。チューブを室温でインキュベートし、デジタルシェーカーで900 RPMで10分間混合します。標的リボソームRNAを含む溶液からビーズを磁気スタンドで室温で1分間分離します。
溶出した陽性画分を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに集めます。免疫蛍光イメージングは、Cyp17-Cre陽性NuTRAPフロックスおよびCyp17-Cre陰性NuTRAPフロックスマウスのパラフィン化卵巣に対して実施した。EGFPタンパク質は、ヤギ抗GFP一次抗体およびAlexa 488ロバ抗ヤギ二次抗体を用いて染色し、核をDAPIで染色した。
画像は蛍光顕微鏡で20倍の倍率で撮影されました。インプットおよびTRAP陽性画分RNAをCyp17-Cre陽性NuTRAPフロックスマウス卵巣から単離し、対末端様式で配列決定した。発現した全ての遺伝子の主成分分析は、第1成分におけるTRAPインプットと陽性画分の分離を示した。
入力分数と正分数の間で発現差のある遺伝子の火山プロットがここに示されています。TRAP陽性画分と入力値の比較は、間質/テカ細胞マーカー遺伝子の全体的な濃縮と、TRAP陽性画分における卵母細胞、顆粒膜、免疫、および平滑筋細胞マーカー遺伝子の枯渇を示しました。解離していない血管を除去するための核懸濁液の最初の遠心分離の後、核は上清中にある。
この時点で、上清を必ず保持し、ペレットを廃棄してください。インタクトな方法に続いて、クロマチンアクセシビリティやDNA修飾のアッセイなど、いくつかのエピゲノム技術を実施できます。TRAP法に続いて、RT-qCPRまたはRNAシーケンシングを実施してトランスラトームを評価することができます。
これは、マウス卵巣におけるNuTRAP法の最初の適用です。これにより、特定の卵巣細胞タイプからのハイスループットエピゲノムおよびトランスクリプトーム解析が可能になり、卵巣の老化や癌の研究に使用できます。
