Este método fornece uma técnica para isolar ácidos nucleicos de populações específicas de células ovarianas do mesmo camundongo sem a necessidade de triagem celular. Esta técnica pode ajudar a identificar como populações celulares específicas estão mudando sob uma variedade de condições. Por exemplo, com o envelhecimento.
A principal vantagem desta técnica é que ela permite a análise epigenômica e transcriptômica pareada de um tipo específico de célula ovariana sem a necessidade de triagem celular. Isso aumenta significativamente o rendimento, diminui o custo e elimina a necessidade de equipamentos especializados ao realizar análises específicas do tipo celular do tecido ovariano. Aqui, nosso objetivo é identificar as alterações específicas do tipo celular que ocorrem com o envelhecimento ovariano antes da senescência reprodutiva, o que tem implicações no tratamento da infertilidade feminina.
Este método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula em sistemas do corpo para os quais um driver Cre específico do tipo de célula está disponível. A parte mais difícil desta técnica é escolher uma linha Cre apropriada para o seu tipo de célula de interesse. Recomenda-se a validação extensiva da especificidade celular.
Para começar, colete um ovário do camundongo eutanasiado em 500 microlitros de tampão de lise nuclear e pique o ovário em oito partes dentro do tampão usando microtesouras de abertura automática. Transfira o ovário picado e o tampão de lise para um homogeneizador de vidro sobre gelo e homogeneize o ovário 10 a 20 vezes com o pilão solto A.Adicione 400 microlitros de tampão de lise ao pilão de lavagem homogeneizador de dounce A.E homogeneize o ovário com pilão B apertado 10 a 20 vezes. Transfira o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de dois mililitros e centrifugar a 200 g por 1,5 minutos a quatro graus Celsius para remover o tecido indissociado e os vasos sanguíneos.
Depois de pré-umedecer um filtro de células de 30 micrômetros com 100 microlitros de tampão de lise, filtre o sobrenadante através do filtro em um tubo cônico de 15 mililitros. Transfira os núcleos contendo a mistura para um tubo de fundo redondo de dois mililitros. Centrifugar a amostra a 500 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.
Ressuspender a pelota de núcleos em 250 microlitros de tampão de lise gelada por vórtice brevemente em velocidade moderada a alta. Aumente o volume para 1,75 mililitros adicionando 1,5 mililitros de tampão de lise. Misture delicadamente e descanse a suspensão dos núcleos no gelo por cinco minutos.
Pelotar os núcleos por centrifugação a 500 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. E descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pelota do núcleo. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de armazenamento gelado e vórtice brevemente para ressuspender completamente o pellet do núcleo.
Reserve 10% do pellet ressuspendido como amostra de núcleos de entrada para análise a jusante. Pegue o palete de núcleos ressuspendidos e perfaça o volume para dois mililitros com tampão de purificação nuclear gelado, ou NPB. Adicione 30 microlitros de contas ressuspensas para cada amostra em um tubo de fundo redondo de dois mililitros.
Em seguida, adicione um mililitro de NPB e ressuspenda bem por pipetagem. Coloque o tubo no rack magnético por um minuto para separar as contas. Descarte o sobrenadante e remova o tubo do ímã.
Ressuspenda as esferas magnéticas lavadas em um mililitro de NPB. Repita a etapa de lavagem para um total de três lavagens. E após a lavagem final, ressuspenda as contas no volume inicial do NPB.
Adicione 30 microlitros das contas lavadas a dois mililitros da suspensão nuclear e ressuspenda bem a mistura dos núcleos das contas pipetando e invertendo suavemente o tubo. Coloque os tubos em um misturador rotativo em uma câmara fria ou geladeira por 30 minutos em baixa velocidade e incube as amostras de entrada sem contas nas mesmas condições. Coloque os tubos com a suspensão de núcleos e as contas sobre o ímã por três minutos para separar os núcleos biotinilados ligados às esferas de estreptavidina da fração negativa dos núcleos.
Remova o sobrenadante. Passe a fração negativa para um tubo fresco de dois mililitros e reserve-a no gelo. Para cada tubo de fração positiva, remova o tubo do ímã e ressuspenda o conteúdo em um mililitro de NPB.
Coloque o tubo sobre o ímã por um minuto e descarte o sobrenadante. Ressuspender a mistura de núcleos fracionados da fração positiva em 30 microlitros de NPB. Transfira o ovário e 100 microlitros de tampão de homogeneização para um homogeneizador de vidro e homogeneize 10 a 20 vezes com o pilão solto A.Adicione 400 microlitros de tampão de homogeneização TRAP ao pilão de lavagem A e transfira o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de dois mililitros.
Lave o homogeneizador com mais um mililitro de tampão de homogeneização TRAP e transfira o volume lavado para o tubo de fundo redondo de dois mililitros. Centrifugar o homogeneizado a 12.000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. E transfira o sobrenadante limpo para um tubo de fundo redondo de dois mililitros.
Depois de descartar o pellet, transfira 100 microlitros do homogeneizado limpo para um tubo de fundo redondo de dois mililitros fresco e reserve-o como entrada no gelo. Incubar o restante do homogeneizado limpo com cinco microgramas por mililitro de anticorpo anti-GFP por uma hora a quatro graus Celsius enquanto gira em um misturador de ponta a ponta. Incubar a amostra de entrada na mesma condição.
Transfira 50 microlitros das esferas magnéticas da proteína G para cada amostra em um tubo de fundo redondo de dois mililitros. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem com baixo teor de sal às contas e pipeta suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético por um minuto para coletar as contas contra o lado do tubo.
Depois de descartar o sobrenadante, remova o tubo do suporte magnético e adicione um mililitro de tampão de lavagem com baixo teor de sal ao tubo. Pipetar suavemente para misturar. Novamente, coloque o tubo no suporte magnético e repita o passo para um total de três lavagens.
Após a lavagem final, ressuspenda as contas no volume inicial de tampão de lavagem com baixo teor de sal. Transfira as esferas lavadas ressuspensas para a mistura de anticorpos da amostra de antígeno e incube a quatro graus Celsius durante a noite enquanto gira em um misturador de ponta a ponta. Incubar as amostras de entrada durante a noite nas condições equivalentes.
Depois disso, separe a fração positiva ou as esferas magnéticas com o RNA dos ribossomos alvo da fração negativa ou do sobrenadante usando o suporte magnético por 2,5 a 3 minutos. Aspirar a fração negativa. Coloque-o em um tubo de fundo redondo de dois mililitros fresco e reserve-o no gelo.
Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem com alto teor de sal ao tubo com a fração positiva e pipete suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético mantido sobre gelo por um minuto para separar as contas. Depois de descartar o sobrenadante, retire o tubo do ímã e repita o passo para um total de três lavagens.
Após a lavagem final, ressuspender as esferas em 350 microlitros de tampão de lise de RNA suplementado com 3,5 microlitros de 2-mercaptoetanol. Incubar os tubos à temperatura ambiente enquanto mistura durante 10 minutos a 900 RPM num agitador digital. Separe as esferas da solução que agora contém o RNA dos ribossomos alvo com um suporte magnético por um minuto à temperatura ambiente.
Coletar a fração positiva eluída em um tubo fresco de 1,5 mililitro. A imagem de imunofluorescência foi realizada nos ovários parafinizados de camundongos Cyp17-Cre positivo NuTRAP flox e Cyp17-Cre negativo NuTRAP flox. A proteína EGFP foi corada usando o anticorpo primário de cabra anti-GFP e o anticorpo secundário de Alexa 488 anti-cabra de burro, e os núcleos foram corados com DAPI.
As imagens foram obtidas em microscópio de fluorescência com aumento de 20x. O RNA da fração de entrada e TRAP positivo foi isolado de ovários de camundongos NuTRAP flox Cyp17-Cre positivo e sequenciado de forma pareada. A análise de componentes principais de todos os genes expressos mostrou uma separação da entrada do TRAP e das frações positivas no primeiro componente.
O gráfico vulcânico de genes diferencialmente expressos entre as frações de entrada e positivas é mostrado aqui. A comparação da fração positiva do TRAP com a entrada mostrou um enriquecimento global dos genes marcadores de células do estroma/teca e a depleção dos genes marcadores de ovócitos, granulosas, imunes e de células musculares lisas na fração positiva do TRAP. Após a primeira centrifugação da suspensão nuclear para remover vasos sanguíneos indissociados, os núcleos estão no sobrenadante.
Certifique-se de manter o sobrenadante e descarte o pellet neste ponto. Seguindo o método intacto, várias técnicas epigenômicas podem ser conduzidas, incluindo ensaios de acessibilidade da cromatina ou modificações no DNA, entre outros. Seguindo o método TRAP, RT-qCPR ou sequenciamento de RNA podem ser realizados para avaliar o translatome.
Esta é a primeira aplicação do método NuTRAP no ovário de camundongos. Isso permite análises epigenômicas e transcriptômicas de alto rendimento de tipos específicos de células ovarianas, que podem ser usadas para estudar o envelhecimento ou o câncer ovariano.
