Questo metodo fornisce una tecnica per isolare gli acidi nucleici da specifiche popolazioni di cellule ovariche dallo stesso topo senza la necessità di selezionare le cellule. Questa tecnica può aiutare a identificare come specifiche popolazioni cellulari stanno cambiando in una varietà di condizioni. Ad esempio, con l'invecchiamento.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi epigenomica e trascrittomica accoppiata da uno specifico tipo di cellula ovarica senza la necessità di selezionare le cellule. Ciò aumenta significativamente la produttività, diminuisce i costi ed elimina la necessità di attrezzature specializzate quando si esegue l'analisi specifica del tipo di cellula dal tessuto ovarico. Qui, il nostro obiettivo è identificare i cambiamenti specifici del tipo di cellula che si verificano con l'invecchiamento ovarico prima della senescenza riproduttiva, che ha implicazioni nel trattamento dell'infertilità femminile.
Questo metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula attraverso i sistemi corporei per i quali è disponibile un driver Cre specifico del tipo di cella. La parte più difficile di questa tecnica è scegliere una linea Cre appropriata per il tipo di cellula di interesse. Si raccomanda un'ampia convalida della specificità cellulare.
Per iniziare, raccogliere un'ovaia dal topo eutanasia in 500 microlitri di tampone di lisi nuclei e tritare l'ovaio in otto parti all'interno del tampone usando micro forbici autoapribili. Trasferire l'ovaia tritata e il tampone di lisi in un omogeneizzatore di vetro su ghiaccio e omogeneizzare l'ovaio da 10 a 20 volte con il pestello sciolto A.Aggiungere 400 microlitri di tampone di lisi all'omogeneizzatore di dounce lavando il pestello A.E poi omogeneizzare l'ovaia con pestello stretto B da 10 a 20 volte. Trasferire l'omogenato in un tubo inferiore rotondo da due millilitri e centrifugare a 200 g per 1,5 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere il tessuto non dissociato e i vasi sanguigni.
Dopo aver pre-bagnato un filtro cellulare da 30 micrometri con 100 microlitri di tampone di lisi, filtrare il surnatante attraverso il filtro in un tubo conico da 15 millilitri. Trasferire i nuclei contenenti la miscela in un tubo inferiore rotondo da due millilitri. Centrifugare il campione a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante.
Risospendere il pellet di nuclei in 250 microlitri di tampone di lisi ghiacciato mediante vortice brevemente a velocità da moderata ad alta. Portare il volume fino a 1,75 millilitri aggiungendo 1,5 millilitri di tampone di lisi. Mescolare delicatamente e riposare la sospensione dei nuclei sul ghiaccio per cinque minuti.
Pellettare i nuclei mediante centrifugazione a 500 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. E scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet dei nuclei. Risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone ghiacciato e vortice brevemente per risospendere completamente il pellet nuclei.
Riservare il 10% del pellet risospeso come campione di nuclei in ingresso per l'analisi a valle. Prendi il pallet di nuclei risospeso e porta il volume a due millilitri con tampone di purificazione nucleare ghiacciato, o NPB. Aggiungere 30 microlitri di perline risospese per ciascun campione in un tubo inferiore rotondo da due millilitri.
Quindi aggiungere un millilitro di NPB e risospendere bene mediante pipettaggio. Posizionare il tubo sul rack magnetico per un minuto per separare le perline. Scartare il surnatante e rimuovere il tubo dal magnete.
Risospendere le sfere magnetiche lavate in un millilitro di NPB. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre lavaggi. E dopo il lavaggio finale, risospendere le perline nel volume iniziale di NPB.
Aggiungere 30 microlitri delle perle lavate a due millilitri della sospensione nucleare e risospendere bene la miscela di nuclei di perline pipettando e invertendo delicatamente il tubo. Posizionare i tubi su un miscelatore rotante in una cella frigorifera o frigorifero per 30 minuti a bassa velocità e incubare i campioni di ingresso senza perline nelle stesse condizioni. Posizionare i tubi con la sospensione dei nuclei e le perle sul magnete per tre minuti per separare i nuclei biotinilati legati alle perle di streptavidina dalla frazione negativa dei nuclei.
Rimuovere il surnatante. Passare la frazione negativa a un tubo fresco da due millilitri e riservarlo sul ghiaccio. Per ogni tubo di frazione positiva, rimuovere il tubo dal magnete e risospendere il contenuto in un millilitro di NPB.
Posizionare il tubo sul magnete per un minuto e scartare il surnatante. Risospendere la miscela di nuclei di perline di frazione positiva in 30 microlitri di NPB. Trasferire l'ovaia e 100 microlitri di tampone di omogeneizzazione in un omogeneizzatore di vetro e omogeneizzare da 10 a 20 volte con il pestello sciolto A.Aggiungere 400 microlitri di tampone di omogeneizzazione TRAP al pestello di lavaggio A e trasferire l'omogenato in un tubo inferiore rotondo da due millilitri.
Lavare l'omogeneizzatore con un ulteriore millilitro di tampone di omogeneizzazione TRAP e trasferire il volume lavato sul tubo inferiore rotondo da due millilitri. Centrifugare l'omogenato a 12.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. E trasferire il surnatante eliminato in un tubo inferiore rotondo fresco da due millilitri.
Dopo aver scartato il pellet, trasferire 100 microlitri di omogenato eliminato in un tubo inferiore rotondo fresco da due millilitri e riservarlo come input sul ghiaccio. Incubare il resto dell'omogenato eliminato con cinque microgrammi per millilitro di anticorpo anti-GFP per un'ora a quattro gradi Celsius mentre si ruota in un miscelatore end-over-end. Incubare il campione di input nella stessa condizione.
Trasferire 50 microlitri delle sfere magnetiche della proteina G per ciascun campione in un tubo inferiore rotondo da due millilitri. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale alle perle e pipettare delicatamente per mescolare. Posizionare il tubo in un supporto magnetico per un minuto per raccogliere le perline contro il lato del tubo.
Dopo aver scartato il surnatante, rimuovere il tubo dal supporto magnetico e aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale al tubo. Pipettare delicatamente per mescolare. Ancora una volta, posizionare il tubo nel supporto magnetico e ripetere il passaggio per un totale di tre lavaggi.
Dopo il lavaggio finale, risospendere le perle nel volume iniziale di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale. Trasferire le perle lavate risospese nella miscela di anticorpi del campione di antigene e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte ruotando in un miscelatore end-over-end. Incubare i campioni di input durante la notte nelle condizioni equivalenti.
Successivamente, separare la frazione positiva o le sfere magnetiche con l'RNA ribosomiale bersaglio dalla frazione negativa o dal surnatante usando il supporto magnetico per 2,5-3 minuti. Aspirare la frazione negativa. Mettilo in un tubo inferiore rotondo fresco da due millilitri e mettilo da parte sul ghiaccio.
Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale al tubo con la frazione positiva e pipettare delicatamente per mescolare. Posizionare il tubo su un supporto magnetico mantenuto sul ghiaccio per un minuto per separare le perline. Dopo aver scartato il surnatante, rimuovere il tubo dal magnete e ripetere il passaggio per un totale di tre lavaggi.
Dopo il lavaggio finale, risospendere le perle in 350 microlitri di tampone di lisi RNA integrato con 3,5 microlitri di 2-mercaptoetanolo. Incubare i tubi a temperatura ambiente mescolando per 10 minuti a 900 RPM in uno shaker digitale. Separare le perle dalla soluzione che ora contiene l'RNA ribosomiale bersaglio con un supporto magnetico per un minuto a temperatura ambiente.
Raccogliere la frazione positiva eluita in un tubo fresco da 1,5 millilitri. L'imaging con immunofluorescenza è stato eseguito sulle ovaie paraffinizzate di topi NuTRAP flox Cyp17-Cre positivi e Topi NuTRAP negativi al Cyp17-Cre. La proteina EGFP è stata colorata utilizzando l'anticorpo primario anti-GFP di capra e l'anticorpo secondario anti-capra di Alexa 488 d'asino, e i nuclei sono stati colorati con DAPI.
Le immagini sono state scattate con un microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 20x. L'RNA della frazione positiva di ingresso e TRAP è stato isolato dalle ovaie del topo flox NuTRAP positivo al Cyp17-Cre e sequenziato in modo finale accoppiato. L'analisi dei componenti principali di tutti i geni espressi ha mostrato una separazione dell'input TRAP e delle frazioni positive nel primo componente.
Il grafico del vulcano di geni differenzialmente espressi tra l'input e le frazioni positive è mostrato qui. Il confronto della frazione positiva TRAP con l'input ha mostrato un arricchimento complessivo dei geni marcatori delle cellule stroma/teca e l'esaurimento dei geni marcatori di ovociti, granulosa, cellule immunitarie e muscolari lisce nella frazione positiva TRAP. Dopo la prima centrifugazione della sospensione nucleare per rimuovere i vasi sanguigni non dissociati, i nuclei sono nel surnatante.
Assicurati di conservare il surnatante e scartare il pellet a questo punto. Seguendo il metodo intatto, possono essere condotte diverse tecniche epigenomiche, tra cui saggi per l'accessibilità della cromatina o modifiche del DNA, tra gli altri. Seguendo il metodo TRAP, è possibile condurre il sequenziamento RT-qCPR o RNA per valutare il translatoma.
Questa è la prima applicazione del metodo NuTRAP nell'ovaio del topo. Ciò consente un'analisi epigenomica e trascrittomica ad alto rendimento da specifici tipi di cellule ovariche, che possono essere utilizzate per studiare l'invecchiamento ovarico o il cancro.
