Este método proporciona una técnica para aislar ácidos nucleicos de poblaciones específicas de células ováricas del mismo ratón sin necesidad de clasificación celular. Esta técnica puede ayudar a identificar cómo las poblaciones celulares específicas están cambiando bajo una variedad de condiciones. Por ejemplo, con el envejecimiento.
La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis epigenómico y transcriptómico pareado de un tipo específico de célula ovárica sin necesidad de clasificación celular. Esto aumenta significativamente el rendimiento, disminuye el costo y elimina la necesidad de equipos especializados al realizar análisis específicos del tipo de célula del tejido ovárico. Aquí, nuestro objetivo es identificar los cambios específicos del tipo de célula que ocurren con el envejecimiento ovárico antes de la senescencia reproductiva, lo que tiene implicaciones en el tratamiento de la infertilidad femenina.
Este método se puede aplicar a cualquier tipo de célula en todos los sistemas del cuerpo para los que se dispone de un controlador Cre específico del tipo de célula. La parte más difícil de esta técnica es elegir una línea Cre apropiada para su tipo de célula de interés. Se recomienda una validación exhaustiva de la especificidad celular.
Para comenzar, recoja un ovario del ratón sacrificado en 500 microlitros de tampón de lisis de núcleos y corte el ovario en ocho partes dentro del tampón usando microtijeras de apertura automática. Transfiera el ovario picado y el tampón de lisis a un homogeneizador de rebote de vidrio en hielo y homogeneice el ovario de 10 a 20 veces con el mortero suelto A.Agregue 400 microlitros de tampón de lisis al mortero de lavado del homogeneizador de rebote A.Y luego homogeneice el ovario con mortero B apretado de 10 a 20 veces. Transfiera el homogeneizado a un tubo inferior redondo de dos mililitros y centrifugar a 200 g durante 1,5 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar el tejido y los vasos sanguíneos no disociados.
Después de humedecer previamente un filtro celular de 30 micrómetros con 100 microlitros de tampón de lisis, filtre el sobrenadante a través del filtro en un tubo cónico de 15 mililitros. Transfiera los núcleos que contienen la mezcla a un tubo inferior redondo de dos mililitros. Centrifugar la muestra a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.
Resuspender el pellet de núcleos en 250 microlitros de tampón de lisis helada enfriando vórtice brevemente a velocidad moderada a alta. Lleve el volumen hasta 1.75 mililitros agregando 1.5 mililitros de tampón de lisis. Mezclar suavemente y descansar la suspensión de núcleos en hielo durante cinco minutos.
Granular los núcleos por centrifugación a 500 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet de núcleos. Resuspender el pellet en 200 microlitros de tampón de almacenamiento en frío de hielo y vórtice brevemente para resuspender completamente el pellet de núcleos.
Reservar el 10% del pellet resuspendido como muestra de núcleos de entrada para el análisis posterior. Tome la paleta de núcleos resuspendidos y enrase el volumen a dos mililitros con un tampón de purificación nuclear helado, o NPB. Agregue 30 microlitros de perlas resuspendidas para cada muestra en un tubo inferior redondo de dos mililitros.
Luego agregue un mililitro de NPB y resuspenda bien pipeteando. Coloque el tubo en la rejilla magnética durante un minuto para separar las cuentas. Deseche el sobrenadante y retire el tubo del imán.
Resuspenda las perlas magnéticas lavadas en un mililitro de NPB. Repita el paso de lavado para un total de tres lavados. Y después del lavado final, vuelva a suspender las perlas en el volumen inicial de NPB.
Agregue 30 microlitros de las perlas lavadas a dos mililitros de la suspensión nuclear y resuspenda bien la mezcla de núcleos de perlas pipeteando e invirtiendo suavemente el tubo. Coloque los tubos en un mezclador giratorio en una cámara frigorífica o refrigerador durante 30 minutos a baja velocidad e incube las muestras de entrada sin perlas en las mismas condiciones. Coloque los tubos con la suspensión de núcleos y las perlas en el imán durante tres minutos para separar los núcleos biotinilados unidos a las perlas de estreptavidina de la fracción negativa de los núcleos.
Retire el sobrenadante. Pase la fracción negativa a un tubo fresco de dos mililitros y resérvela en hielo. Para cada tubo de fracción positiva, retire el tubo del imán y vuelva a suspender el contenido en un mililitro de NPB.
Coloque el tubo en el imán durante un minuto y deseche el sobrenadante. Resuspender la mezcla de núcleos de perlas de fracción positiva en 30 microlitros de NPB. Transfiera el ovario y 100 microlitros de tampón de homogeneización a un homogeneizador de rebote de vidrio y homogeneice de 10 a 20 veces con el mortero suelto A.Agregue 400 microlitros de tampón de homogeneización TRAP al mortero de lavado A y transfiera el homogeneizado a un tubo inferior redondo de dos mililitros.
Lave el homogeneizador con un mililitro adicional de tampón de homogeneización TRAP y transfiera el volumen lavado al tubo inferior redondo de dos mililitros. Centrifugar el homogeneizado a 12, 000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Y transfiera el sobrenadante despejado a un tubo inferior redondo fresco de dos mililitros.
Después de desechar el pellet, transfiera 100 microlitros del homogeneizado aclarado a un tubo inferior redondo fresco de dos mililitros y resérvelo como entrada en hielo. Incubar el resto del homogeneizado aclarado con cinco microgramos por mililitro de anticuerpo anti-GFP durante una hora a cuatro grados centígrados mientras gira en un mezclador de extremo a extremo. Incubar la muestra de entrada en la misma condición.
Transfiera 50 microlitros de las perlas magnéticas de proteína G para cada muestra a un tubo inferior redondo de dos mililitros. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado bajo en sal a las perlas y pipete suavemente para mezclar. Coloque el tubo en un soporte magnético durante un minuto para recoger las perlas contra el costado del tubo.
Después de desechar el sobrenadante, retire el tubo del soporte magnético y agregue un mililitro de tampón de lavado bajo en sal al tubo. Pipetear suavemente para mezclar. Nuevamente, coloque el tubo en el soporte magnético y repita el paso para un total de tres lavados.
Después del lavado final, vuelva a suspender las perlas en el volumen inicial de tampón de lavado bajo en sal. Transfiera las perlas lavadas resuspendidas a la mezcla de anticuerpos de la muestra de antígeno e incube a cuatro grados centígrados durante la noche mientras gira en un mezclador de extremo a extremo. Incubar las muestras de entrada durante la noche en las condiciones equivalentes.
Después de eso, separe la fracción positiva o las perlas magnéticas con el ARN de los ribosomas objetivo de la fracción negativa o el sobrenadante usando el soporte magnético durante 2.5 a 3 minutos. Aspirar la fracción negativa. Colóquelo en un tubo inferior redondo fresco de dos mililitros y déjelo a un lado en hielo.
Agregue 500 microlitros de tampón de lavado con alto contenido de sal al tubo con la fracción positiva y pipete suavemente para mezclar. Coloque el tubo en un soporte magnético mantenido sobre hielo durante un minuto para separar las cuentas. Después de desechar el sobrenadante, retire el tubo del imán y repita el paso para un total de tres lavados.
Después del lavado final, vuelva a suspender las perlas en 350 microlitros de tampón de lisis de ARN complementado con 3,5 microlitros de 2-mercaptoetanol. Incubar los tubos a temperatura ambiente mientras se mezclan durante 10 minutos a 900 RPM en una coctelera digital. Separe las perlas de la solución que ahora contiene el ARN de los ribosomas objetivo con un soporte magnético durante un minuto a temperatura ambiente.
Recoja la fracción positiva eluyente en un tubo fresco de 1,5 mililitros. Se realizaron imágenes de inmunofluorescencia en los ovarios parafinados de ratones Cyp17-Cre positivos NuTRAP flox y Cyp17-Cre negativos NuTRAP flox. La proteína EGFP se tiñó con el anticuerpo primario anti-GFP de cabra y el anticuerpo secundario anti-cabra de burro Alexa 488, y los núcleos se tiñeron con DAPI.
Las imágenes se tomaron en un microscopio de fluorescencia con un aumento de 20x. El ARN de entrada y fracción positiva TRAP se aisló de los ovarios de ratón NuTRAP flox positivos para Cyp17-Cre y se secuenció de manera pareada. El análisis de componentes principales de todos los genes expresados mostró una separación de la entrada de TRAP y fracciones positivas en el primer componente.
Aquí se muestra el diagrama volcánico de genes expresados diferencialmente entre las fracciones de entrada y positivas. La comparación de la fracción positiva de TRAP con la entrada mostró un enriquecimiento general de los genes marcadores de células estroma/teca y el agotamiento de los genes marcadores de células del ovocito, la granulosa, el sistema inmunitario y el músculo liso en la fracción positiva para TRAP. Después de la primera centrifugación de la suspensión nuclear para eliminar los vasos sanguíneos no disociados, los núcleos están en el sobrenadante.
Asegúrese de mantener el sobrenadante y deseche el pellet en este punto. Siguiendo el método intacto, se pueden realizar varias técnicas epigenómicas, incluidos ensayos para la accesibilidad a la cromatina o modificaciones del ADN, entre otros. Siguiendo el método TRAP, se puede realizar RT-qCPR o secuenciación de ARN para evaluar el translatome.
Esta es la primera aplicación del método NuTRAP en el ovario del ratón. Esto permite un análisis epigenómico y transcriptómico de alto rendimiento de tipos específicos de células ováricas, que pueden usarse para estudiar el envejecimiento ovárico o el cáncer.
