实时定量IS200/IS605家族相关TnpB对转座子活性的影响

该协议允许我们在单细胞的基础上量化切除统计数据，而不是查看批量行为。在这个水平上，我们可以跟踪单个细胞随时间推移的行为，包括切除细胞与不切除细胞的TnpA和TnpB水平，例如，这可以让我们测量已识别的突变事件对生长速率的影响。这种方法是一种简单、低成本的活细胞突变动力学测量方法。

一般方法适用于任何需要活细胞荧光成像的系统。通过在微波炉中将M63与0.5%葡萄糖和1.5%琼脂糖煮沸以融化琼脂糖来制备载玻片。确保介质完全熔化并充分混合。

让混合物冷却至55摄氏度，然后再加入抗生素和诱导剂。将显微镜载玻片放在工作台上。垂直于第一张幻灯片堆叠一张幻灯片。

确保底部和顶部载玻片之间的间隙等于一个载玻片厚度。将一毫升M63琼脂糖混合物缓慢移入载玻片之间的间隙中，以形成一个小的凝胶方块。凝胶凝固后，滑动顶部载玻片将其取出。

用剃须刀片或刀修剪琼脂糖垫。然后，移液2.5微升细菌培养物，并将盖玻片放在上面。用环氧树脂密封载玻片和盖玻片之间的空间。

让环氧树脂干燥，细胞在37摄氏度下沉淀在琼脂糖垫上一小时。将制备的样品放在加热并保持在37摄氏度的环境中的荧光显微镜上。对于每个波长，找到包含最小荧光的视场。

设置协议以不同波长和固定时间间隔采集网格中的图像。转座子切除事件导致mCerulean3启动子的重建，允许通过亮蓝色荧光鉴定经历转座子活性的细胞。TnpB提高转座子切除率。

与TnpB阴性细胞相比，表达辅助蛋白TnpB的细胞的转座子活性水平高四到五倍。在TnpB阳性细胞中，经历转座子切除事件的细胞具有比一般人群更高的mCherry TnpB表达水平。此外，对于经历切除事件的细胞，TnpB阳性细胞仅表达略高于TnpB阴性细胞的静脉TnpA转座酶水平，高于一般人群的黄色荧光。

最有可能挣扎的地方是为实验准备细胞培养物。您应该确保细胞生长到指数期，并且载玻片接种了适当数量的细胞。密封载玻片时请记住注意气泡，以免琼脂糖凝胶变干。