כימות בזמן אמת של ההשפעות של TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 על פעילות טרנספוזון

פרוטוקול זה מאפשר לנו לכמת סטטיסטיקות כריתה על בסיס תא בודד, בניגוד להסתכלות על התנהגות בתפזורת. ברמה זו, אנו יכולים לעקוב אחר ההתנהגות של תאים בודדים לאורך זמן, כולל רמות ה-TnpA וה-TnpB שלהם עבור תאים שנכנסים לעומת תאים שלא, מה שיכול לאפשר לנו, למשל, למדוד את ההשפעות של אירועים מוטציוניים מזוהים על קצב הגדילה. שיטה זו היא דרך פשוטה וזולה למדוד דינמיקה של מוטציות בתאים חיים.

הגישה הכללית ישימה לכל מערכת הדורשת הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים. הכינו שקופית על ידי הרתחת M63 עם 0.5% גלוקוז ו-1.5% אגרוז במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז. ודא כי המדיום הוא נמס לחלוטין מעורבב היטב.

תנו לתערובת להתקרר ל-55 מעלות צלזיוס לפני הוספת אנטיביוטיקה ומשרה. הנח שקופית מיקרוסקופ על שולחן העבודה. ערימת שקופית אחת בניצב לשקופית הראשונה.

ודא שיש רווח השווה לעובי שקופית אחת בין השקופית התחתונה לשקופית העליונה. פיפטה מיליליטר אחד של תערובת האגרוז M63 לתוך המרווח בין המגלשה באיטיות ליצירת ריבוע ג'ל קטן. לאחר שהג'ל התמצק, החלק את השקופית העליונה כדי להסיר אותו.

גזרו את כרית האגרוז בעזרת סכין גילוח או סכין. לאחר מכן, פיפטה 2.5 microliters של תרבית חיידקים ולשים את הכיסוי להחליק על גבי. אטמו את הרווח בין המגלשה למכסה באמצעות אפוקסי.

תנו לאפוקסי להתייבש ולתאים להתיישב על כרית האגרוז למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מניחים את הדגימה המוכנה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בסביבה מחוממת ומתוחזקת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עבור כל אורך גל, מצא את שדה הראייה המכיל פלואורסצנציה מינימלית.

הגדר פרוטוקול להשגת תמונות ברשת באורכי גל שונים ובמרווחי זמן קבועים. אירועי כריתה של טרנספוזון גורמים לבנייה מחדש של המקדם עבור mCerulean3, ומאפשרים זיהוי של תאים העוברים פעילות טרנספוזון על ידי פלואורסצנציה כחולה בהירה. TnpB משפר את קצב כריתת הטרנספוזון.

תאים המבטאים חלבון אביזר TnpB חווים רמות גבוהות פי ארבעה עד חמישה של פעילות טרנספוזון בהשוואה לתאים שליליים ל-TnpB. בתאים חיוביים ל-TnpB, לתאים שעוברים אירועי כריתת טרנספוזון יש רמות ביטוי גבוהות יותר של mCherry TnpB מאשר באוכלוסייה הכללית. יתר על כן, עבור תאים העוברים אירועי כריתה, תאים חיוביים ל-TnpB מבטאים רק רמות גבוהות יותר באופן שולי של TnpA-טרנספוזאז מאשר תאים שליליים ל-TnpB, שהם גבוהים יותר מהפלואורסצנטיות הצהובה של האוכלוסייה הכללית.

המקום הסביר ביותר להיאבק בו הוא בהכנת תרבית התאים לניסוי. עליך לוודא שהתאים גדלים לפאזה מעריכית ושהשקופית מחוסנת במספר מתאים של תאים. זכרו להיזהר מבועות בעת איטום המגלשה כדי שג'ל האגרוז לא יתייבש.