Количественная оценка влияния TnpB, связанного с семейством IS200/IS605, на транспозонную активность в режиме реального времени

Этот протокол позволяет нам количественно оценивать статистику иссечения на основе одной клетки, в отличие от рассмотрения массового поведения. На этом уровне мы можем отслеживать поведение отдельных клеток с течением времени, включая их уровни TnpA и TnpB для клеток, которые иссечиваются, по сравнению с клетками, которые этого не делают, что может позволить нам, например, измерить влияние идентифицированных мутационных событий на скорость роста. Этот метод является простым и недорогим способом измерения мутационной динамики живых клеток.

Общий подход применим к любой системе, требующей флуоресцентной визуализации живых клеток. Приготовьте слайд, кипятя M63 с 0,5% глюкозы и 1,5% агарозы в микроволновой печи, чтобы растопить агарозу. Убедитесь, что среда полностью расплавлена и хорошо перемешана.

Дайте смеси остыть до 55 градусов цельсия перед добавлением антибиотиков и индукторов. Поместите предметное стекло микроскопа на верстак. Сложите один слайд перпендикулярно первому.

Убедитесь, что между нижним и верхним слайдом имеется зазор, равный одной толщине затвора. Пипетка один миллилитр смеси агарозы М63 медленно в щель между затворами, чтобы создать небольшой гель-квадрат. Как только гель затвердеет, сдвиньте верхний слайд, чтобы удалить его.

Обрежьте подушечку агарозы лезвием бритвы или ножом. Затем пипетку 2,5 микролитра бактериальной культуры и сверху положите крышку. Запечатайте пространство между затвором и крышкой с помощью эпоксидной смолы.

Дайте эпоксидной смоле высохнуть, и клетки осядут на агарозной подушке в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. Поместите подготовленный образец на флуоресцентный микроскоп в среду, нагретую и поддерживаемую при 37 градусах Цельсия. Для каждой длины волны найдите поле зрения, содержащее минимальную флуоресценцию.

Настройте протокол для получения изображений в сетке на разных длинах волн и через регулярные промежутки времени. События транспозонного иссечения приводят к восстановлению промотора для mCerulean3, что позволяет идентифицировать клетки, подвергающиеся транспозонной активности, с помощью ярко-синей флуоресценции. TnpB повышает скорость транспозонного иссечения.

Клетки, экспрессирующие вспомогательный белок TnpB, испытывают в четыре-пять раз более высокие уровни транспозонной активности по сравнению с TnpB-отрицательными клетками. В TnpB-положительных клетках клетки, подвергающиеся транспозонному иссечению, имеют более высокие уровни экспрессии mCherry TnpB, чем в общей популяции. Более того, для клеток, подвергающихся иссечению, TnpB-положительные клетки экспрессируют лишь незначительно более высокие уровни венозной TnpA-транспозазы, чем TnpB-отрицательные клетки, что выше, чем желтая флуоресценция общей популяции.

Наиболее вероятным местом для борьбы является подготовка клеточной культуры к эксперименту. Вы должны убедиться, что клетки выращены до экспоненциальной фазы и что слайд привит соответствующим количеством клеток. Не забывайте следить за пузырьками при запечатывании слайда, чтобы агарозный гель не высох.