このプロトコルにより、バルク挙動を調べるのではなく、単一細胞ベースで切除統計を定量化することができます。このレベルでは、切除する細胞と切除しない細胞のTnpAおよびTnpBレベルなど、個々の細胞の挙動を経時的に追跡できるため、たとえば、特定された突然変異イベントが成長率に及ぼす影響を測定できます。この方法は、生細胞の突然変異動態を測定するための簡単で低コストな方法です。
一般的なアプローチは、生細胞蛍光イメージングを必要とするあらゆるシステムに適用できます。M63を電子レンジで0.5%グルコースと1.5%アガロースで沸騰させてアガロースを溶かしてスライドを準備します。培地が完全に溶け、よく混合されていることを確認してください。
抗生物質と誘導剤を加える前に、混合物を摂氏55度に冷ましてください。顕微鏡スライドを作業台に置きます。1 つのスライドを最初のスライドと垂直に積み重ねます。
下部スライドと上部スライドの間にスライドの厚さが 1 つ等しい隙間があることを確認します。1ミリリットルのM63アガロース混合物をスライド間の隙間にゆっくりとピペットで入れ、小さなゲルの正方形を作り出した。ゲルが固まったら、上部のスライドをスライドさせて取り除きます。
かみそりの刃またはナイフでアガロースパッドを切り取ります。次に、2.5マイクロリットルの細菌培養物をピペットで入れ、カバースリップを上に置きます。スライドとカバースリップの間のスペースをエポキシでシールします。
エポキシを乾燥させ、細胞を摂氏37度で1時間アガロースパッドに沈降させます。調製したサンプルを、摂氏37度に加熱・維持した環境下で蛍光顕微鏡上に置きます。各波長について、最小蛍光を含む視野を見つけます。
グリッド内の画像を異なる波長で一定の時間間隔で取得するためのプロトコルを設定します。トランスポゾン切除イベントは、mCerulean3のプロモーターの再構成をもたらし、明るい青色蛍光によってトランスポゾン活性を受けている細胞の同定を可能にします。TnpBはトランスポゾン切除率を高めます。
アクセサリータンパク質TnpBを発現する細胞は、TnpB陰性細胞と比較して4〜5倍高いレベルのトランスポゾン活性を経験します。TnpB陽性細胞において、トランスポゾン切除事象を受けている細胞は、一般集団よりもmCherry TnpBの発現レベルが高い。さらに、切除イベントを受けている細胞の場合、TnpB陽性細胞はTnpB陰性細胞よりもわずかに高いレベルの静脈TnpAトランスポザーゼしか発現せず、これは一般集団の黄色蛍光よりも高い。
苦労する可能性が最も高いのは、実験のための細胞培養の準備です。細胞が指数関数的に成長していること、およびスライドに適切な数の細胞が接種されていることを確認する必要があります。スライドを密封するときは、アガロースゲルが乾かないように気泡に注意してください。
