Este protocolo nos permite quantificar as estatísticas de excisão em uma base de célula única, em vez de olhar para o comportamento em massa. Nesse nível, podemos rastrear o comportamento de células individuais ao longo do tempo, incluindo seus níveis de TnpA e TnpB para células que extirpam versus células que não o fazem, o que pode nos permitir, por exemplo, medir os efeitos de eventos mutacionais identificados na taxa de crescimento. Este método é uma maneira simples e de baixo custo de medir a dinâmica mutacional das células vivas.
A abordagem geral é aplicável a qualquer sistema que exija imagens fluorescentes de células vivas. Prepare uma lâmina fervendo M63 com 0,5% de glicose e 1,5% de agarose no micro-ondas para derreter a agarose. Certifique-se de que o meio esteja completamente derretido e bem misturado.
Deixe a mistura esfriar a 55 graus Celsius antes de adicionar antibióticos e indutores. Coloque uma lâmina de microscópio na bancada de trabalho. Empilhe um slide perpendicular ao primeiro.
Verifique se há um espaço igual a uma espessura de slide entre o slide inferior e superior. Pipete um mililitro da mistura de agarose M63 no espaço entre a lâmina lentamente para criar um pequeno quadrado de gel. Uma vez que o gel tenha solidificado, deslize a parte superior para removê-lo.
Apare a almofada de agarose com uma lâmina de barbear ou faca. Em seguida, pipete 2,5 microlitros da cultura bacteriana e coloque a tampa deslize por cima. Selar o espaço entre a lâmina e a tampa com epóxi.
Deixe o epóxi secar e as células se depositem na almofada de agarose por uma hora a 37 graus Celsius. Coloque a amostra preparada em um microscópio de fluorescência em um ambiente aquecido e mantido a 37 graus Celsius. Para cada comprimento de onda, encontre o campo de visão que contém fluorescência mínima.
Configure um protocolo para adquirir imagens em uma grade em diferentes comprimentos de onda e em intervalos de tempo regulares. Eventos de excisão de transposon resultam na reconstituição do promotor de mCerulean3, permitindo a identificação de células submetidas à atividade de transposon por fluorescência azul brilhante. O TnpB aumenta a taxa de excisão de transposon.
As células que expressam a proteína acessória TnpB experimentam níveis quatro a cinco vezes mais altos de atividade de transposon em comparação com as células TnpB-negativas. Em células positivas para TnpB, as células submetidas a eventos de excisão de transposon têm níveis de expressão mais elevados de mCherry TnpB do que a população em geral. Além disso, para as células submetidas a eventos de excisão, as células positivas para TnpB expressam níveis apenas marginalmente mais elevados de TnpA-transposase venosa do que as células TnpB-negativas, que é superior à fluorescência amarela da população em geral.
O lugar mais provável para lutar é na preparação da cultura de células para o experimento. Você deve certificar-se de que as células são cultivadas para a fase exponencial e que a lâmina é inoculada com um número apropriado de células. Lembre-se de tomar cuidado com as bolhas ao selar a lâmina para que o gel de agarose não seque.
