이 프로토콜을 사용하면 대량 거동을 보는 대신 단일 세포 기준으로 절제 통계를 정량화할 수 있습니다. 이 수준에서 우리는 소비하는 세포와 그렇지 않은 세포에 대한 TnpA 및 TnpB 수준을 포함하여 시간 경과에 따른 개별 세포의 행동을 추적할 수 있으며, 이를 통해 예를 들어 확인된 돌연변이 사건이 성장률에 미치는 영향을 측정할 수 있습니다. 이 방법은 살아있는 세포 돌연변이 역학을 측정하는 간단하고 저렴한 방법입니다.
일반적인 접근 방식은 라이브 셀 형광 이미징이 필요한 모든 시스템에 적용할 수 있습니다. M63을 전자레인지에 0.5% 포도당과 1.5% 아가로스로 끓여 슬라이드를 준비하여 아가로스를 녹입니다. 배지가 완전히 녹고 잘 혼합되었는지 확인하십시오.
항생제와 유도제를 추가하기 전에 혼합물을 섭씨 55도까지 식히십시오. 작업대에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 하나의 슬라이드를 첫 번째 슬라이드에 수직으로 쌓습니다.
아래쪽 슬라이드와 위쪽 슬라이드 사이에 한 슬라이드 두께와 같은 간격이 있는지 확인합니다. M63 아가로스 혼합물 1 밀리리터를 슬라이드 사이의 틈새에 천천히 피펫팅하여 작은 젤 사각형을 만듭니다. 젤이 굳어지면 상단 슬라이드를 밀어 제거합니다.
면도날이나 칼로 아가 로스 패드를 다듬습니다. 이어서, 2.5 마이크로리터의 박테리아 배양물을 피펫팅하고 그 위에 커버 슬립을 놓는다. 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공간을 에폭시로 밀봉하십시오.
에폭시를 건조시키고 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 아가로스 패드에 정착시킵니다. 준비된 샘플을 섭씨 37도로 가열되고 유지되는 환경에서 형광 현미경에 놓습니다. 각 파장에 대해 최소 형광을 포함하는 시야를 찾으십시오.
서로 다른 파장과 일정한 시간 간격으로 그리드에서 이미지를 수집하도록 프로토콜을 설정합니다. 트랜스포존 절제 이벤트는 mCerulean3에 대한 프로모터의 재구성을 초래하여 밝은 파란색 형광에 의해 트랜스포존 활성을 겪는 세포를 식별할 수 있습니다. TnpB는 트랜스포존 절제 속도를 향상시킵니다.
보조 단백질 TnpB를 발현하는 세포는 TnpB 음성 세포에 비해 4-5배 더 높은 수준의 트랜스포존 활성을 경험합니다. TnpB 양성 세포에서 트랜스포존 절제 이벤트를 겪는 세포는 일반 집단보다 mCherry TnpB의 발현 수준이 더 높습니다. 또한, 절제 사건을 겪는 세포의 경우, TnpB 양성 세포는 TnpB 음성 세포보다 약간 더 높은 수준의 정맥 TnpA- 트랜스 포제 만 발현하며, 이는 일반 집단의 황색 형광보다 높습니다.
어려움을 겪을 가능성이 가장 높은 곳은 실험을위한 세포 배양 준비입니다. 세포가 기하 급수적으로 성장하고 슬라이드에 적절한 수의 세포가 접종되었는지 확인해야합니다. 슬라이드를 밀봉할 때 기포가 생기지 않도록 주의하여 아가로스 젤이 마르지 않도록 하십시오.
