Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Exzisionsstatistiken auf Einzelzellbasis zu quantifizieren, anstatt das Massenverhalten zu betrachten. Auf dieser Ebene können wir das Verhalten einzelner Zellen im Laufe der Zeit verfolgen, einschließlich ihrer TnpA- und TnpB-Spiegel für Zellen, die ausschneiden, im Vergleich zu Zellen, die dies nicht tun, was es uns beispielsweise ermöglichen kann, die Auswirkungen identifizierter Mutationsereignisse auf die Wachstumsrate zu messen. Diese Methode ist eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, die Dynamik der Mutation lebender Zellen zu messen.
Der allgemeine Ansatz ist auf jedes System anwendbar, das eine Lebendzellfluoreszenzbildgebung erfordert. Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie M63 mit 0,5% Glucose und 1,5% Agarose in der Mikrowelle kochen, um die Agarose zu schmelzen. Stellen Sie sicher, dass das Medium vollständig aufgeschmolzen und gut durchmischt ist.
Lassen Sie die Mischung auf 55 Grad Celsius abkühlen, bevor Sie Antibiotika und Induktoren hinzufügen. Legen Sie einen Objektträger auf die Werkbank. Stapeln Sie eine Folie senkrecht zur ersten.
Stellen Sie sicher, dass zwischen dem unteren und oberen Schlitten ein Spalt vorhanden ist, der einer Objektträgerstärke entspricht. Pipettieren Sie einen Milliliter der M63-Agarosemischung langsam in den Spalt zwischen dem Objektträger, um ein kleines Gelquadrat zu erzeugen. Sobald das Gel erstarrt ist, schieben Sie den oberen Objektträger, um ihn zu entfernen.
Schneiden Sie das Agarosettenkissen mit einer Rasierklinge oder einem Messer ab. Dann pipetten Sie 2,5 Mikroliter der Bakterienkultur und legen Sie den Deckstreifen darauf. Versiegeln Sie den Raum zwischen dem Objektträger und dem Abdeckglas mit Epoxidharz.
Lassen Sie das Epoxidharz trocknen und die Zellen setzen sich eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius auf dem Agarosepad ab. Legen Sie die vorbereitete Probe auf ein Fluoreszenzmikroskop in einer Umgebung, die auf 37 Grad Celsius erhitzt und gehalten wird. Suchen Sie für jede Wellenlänge das Sichtfeld mit minimaler Fluoreszenz.
Richten Sie ein Protokoll ein, um Bilder in einem Raster bei verschiedenen Wellenlängen und in regelmäßigen Zeitintervallen zu erfassen. Transposon-Exzisionsereignisse führen zur Rekonstitution des Promotors für mCerulean3, was die Identifizierung von Zellen ermöglicht, die Transposonaktivität durch hellblaue Fluoreszenz durchlaufen. TnpB erhöht die Transposon-Exzisionsrate.
Zellen, die das akzessorische Protein TnpB exprimieren, erfahren eine vier- bis fünfmal höhere Transposonaktivität als TnpB-negative Zellen. In TnpB-positiven Zellen haben Zellen, die Transposon-Exzisionsereignisse durchlaufen, höhere Expressionsniveaus von mCherry TnpB als die Allgemeinbevölkerung. Darüber hinaus exprimieren TnpB-positive Zellen für Zellen, die Exzisionsereignisse durchlaufen, nur geringfügig höhere Konzentrationen venöser TnpA-Transposase als TnpB-negative Zellen, was höher ist als die gelbe Fluoreszenz der Allgemeinbevölkerung.
Der wahrscheinlichste Ort, um zu kämpfen, ist die Vorbereitung der Zellkultur für das Experiment. Sie sollten sicherstellen, dass die Zellen in die exponentielle Phase gezüchtet werden und dass der Objektträger mit einer angemessenen Anzahl von Zellen geimpft ist. Denken Sie daran, beim Versiegeln des Objektträgers auf Blasen zu achten, damit das Agarosegel nicht austrocknet.
