Bu protokol, toplu davranışa bakmak yerine, eksizyon istatistiklerini tek hücreli bir temelde ölçmemizi sağlar. Bu seviyede, bireysel hücrelerin zaman içindeki davranışlarını izleyebiliriz, TnpA ve TnpB seviyeleri de dahil olmak üzere, tüketim vergisi olmayan hücreler için TnpA ve TnpB seviyeleri, örneğin, tanımlanmış mutasyonel olayların büyüme hızı üzerindeki etkilerini ölçmemize izin verebilir. Bu yöntem, canlı hücre mutasyon dinamiklerini ölçmenin basit, düşük maliyetli bir yoludur.
Genel yaklaşım, canlı hücre floresan görüntüleme gerektiren herhangi bir sistem için geçerlidir. Agarozu eritmek için mikrodalgada% 0.5 glikoz ve% 1.5 agaroz ile M63'ü kaynatarak bir slayt hazırlayın. Ortamın tamamen erimiş ve iyi karıştırılmış olduğundan emin olun.
Antibiyotik ve indükleyiciler eklemeden önce karışımın 55 santigrat dereceye kadar soğumasını bekleyin. Çalışma tezgahına bir mikroskop slaytı yerleştirin. Bir slaytı birincisine dik olarak istifleyin.
Alt ve üst kızak arasında bir slayt kalınlığına eşit bir boşluk olduğundan emin olun. Pipetle bir mililitrelik M63 agaroz karışımı arasındaki boşluğa yavaşça kaydırarak küçük bir jel kare oluşturur. Jel katılaştıktan sonra, çıkarmak için üst kaydırağı kaydırın.
Agarose pedini bir tıraş bıçağı veya bıçakla kesin. Daha sonra pipet 2,5 mikrolitre bakteri kültürü ve kapağın üstüne kayar. Sürgü ile kapak kayması arasındaki boşluğu epoksi ile kapatın.
Epoksinin kurumasına ve hücrelerin 37 santigrat derecede bir saat boyunca agaroz pedine yerleşmesine izin verin. Hazırlanan numuneyi floresan mikroskop üzerine ısıtılmış ve 37 santigrat derecede tutulan bir ortama yerleştirin. Her dalga boyu için, minimum floresan içeren görüş alanını bulun.
Farklı dalga boylarında ve düzenli zaman aralıklarında bir ızgaradaki görüntüleri almak için bir protokol ayarlayın. Transpozon eksizyon olayları, mCerulean3 için promotörün yeniden yapılandırılmasıyla sonuçlanır ve transpozon aktivitesi geçiren hücrelerin parlak mavi floresan ile tanımlanmasına izin verir. TnpB transpozon eksizyon oranını arttırır.
Aksesuar protein TnpB'yi eksprese eden hücreler, TnpB-negatif hücrelere kıyasla dört ila beş kat daha yüksek transpozon aktivitesi seviyeleri yaşarlar. TnpB-pozitif hücrelerde, transpozon eksizyon olayları geçiren hücreler, genel popülasyondan daha yüksek mCherry TnpB ekspresyon seviyelerine sahiptir. Dahası, eksizyon olayları geçiren hücreler için, TnpB-pozitif hücreler, genel popülasyonun sarı floresansından daha yüksek olan TnpB-negatif hücrelerden sadece marjinal olarak daha yüksek venöz TnpA-transpozaz seviyelerini eksprese eder.
Mücadele edilecek en muhtemel yer, deney için hücre kültürünün hazırlanmasıdır. Hücrelerin üstel faza büyütüldüğünden ve slaytın uygun sayıda hücreyle aşılandığından emin olmalısınız. Slaytı kapatırken kabarcıklara dikkat etmeyi unutmayın, böylece agaroz jeli kurumaz.
