Ce protocole nous permet de quantifier les statistiques d’excision sur une base de cellule unique, au lieu d’examiner le comportement en vrac. À ce niveau, nous pouvons suivre le comportement des cellules individuelles au fil du temps, y compris leurs niveaux de TnpA et de TnpB pour les cellules qui s’excagent par rapport aux cellules qui ne le font pas, ce qui peut nous permettre, par exemple, de mesurer les effets des événements mutationnels identifiés sur le taux de croissance. Cette méthode est un moyen simple et peu coûteux de mesurer la dynamique mutationnelle des cellules vivantes.
L’approche générale s’applique à tout système nécessitant une imagerie fluorescente de cellules vivantes. Préparez une lame en faisant bouillir M63 avec 0,5% de glucose et 1,5% d’agarose au micro-ondes pour faire fondre l’agarose. Assurez-vous que le milieu est complètement fondu et bien mélangé.
Laissez le mélange refroidir à 55 degrés Celsius avant d’ajouter des antibiotiques et des inducteurs. Placez une lame de microscope sur l’établi. Empilez une lame perpendiculairement à la première.
Assurez-vous qu’il y a un espace égal à une épaisseur de diapositive entre la lame inférieure et supérieure. Pipeter un millilitre du mélange d’agarose M63 dans l’espace entre la lame lentement pour créer un petit carré de gel. Une fois que le gel s’est solidifié, faites glisser la lame supérieure pour l’enlever.
Coupez le tampon d’agarose avec une lame de rasoir ou un couteau. Ensuite, pipeter 2,5 microlitres de la culture bactérienne et mettre le couvercle sur le dessus. Scellez l’espace entre la glissière et le couvercle avec de l’époxy.
Laissez l’époxy sécher et les cellules se déposer sur le tampon d’agarose pendant une heure à 37 degrés Celsius. Placez l’échantillon préparé sur un microscope à fluorescence dans un environnement chauffé et maintenu à 37 degrés Celsius. Pour chaque longueur d’onde, trouvez le champ de vision contenant une fluorescence minimale.
Configurez un protocole pour acquérir des images dans une grille à différentes longueurs d’onde et à intervalles de temps réguliers. Les événements d’excision de transposons entraînent la reconstitution du promoteur de mCerulean3, permettant l’identification des cellules subissant une activité de transposon par fluorescence bleu vif. TnpB augmente le taux d’excision des transposons.
Les cellules exprimant la protéine accessoire TnpB présentent des niveaux quatre à cinq fois plus élevés d’activité des transposons que les cellules TnpB négatives. Dans les cellules TnpB positives, les cellules subissant des événements d’excision de transposons ont des niveaux d’expression plus élevés de tnpB de cerise que la population générale. De plus, pour les cellules subissant des événements d’excision, les cellules TnpB-positives n’expriment que des niveaux légèrement plus élevés de TnpA-transposase veineuse que les cellules TnpB négatives, ce qui est supérieur à la fluorescence jaune de la population générale.
L’endroit le plus probable pour lutter est dans la préparation de la culture cellulaire pour l’expérience. Vous devez vous assurer que les cellules sont cultivées à la phase exponentielle et que la lame est inoculée avec un nombre approprié de cellules. N’oubliez pas de faire attention aux bulles lorsque vous scellez la lame afin que le gel d’agarose ne sèche pas.
