Ainsi, en tirant parti de Z-REX, les chercheurs peuvent interroger comment les réponses de signalisation individuelles sont modifiées en réponse à un ligand réactif spécifique s’engageant avec une protéine d’intérêt spécifique dans des conditions quasi physiologiques chez les larves de poisson zèbre. Les méthodes conventionnelles telles que la dose globale réactive de petites molécules provoquant des cibles et de la toxicité et ne donnent aucun contrôle sur la spécificité de la cible du ligand. Z-REX peut lier un engagement cible de ligand spécifique à un phénotype spécifique avec une grande précision spatio-temporelle.
Nous avons récemment montré comment un métabolite réactif HNE, une cible associée et une voie découverte par Z-REX, permet le développement d’inhibiteurs de kinases spécifiques de l’isoforme de précision contre les cancers du sein triple négatif. Commencez par aligner les embryons dans les rainures d’une plaque d’injection remplie de solution saline équilibrée fraîche à 10% de Hank ou HBSS. Immergez l’extrémité de l’aiguille dans le milieu et, si nécessaire, appliquez des impulsions d’injection pour éliminer les bulles d’air dans l’embout Pour injecter l’embryon, pénétrez le chorion et le sac vitellin en un seul mouvement et appliquez une impulsion d’injection.
Après avoir injecté les autres embryons, rincez-les dans une nouvelle boîte de Petri contenant un média HBSS frais à l’aide d’un flacon d’assaut. Mettez en commun les embryons non injectés dans une autre plaque. Pour effectuer l’analyse du traitement Z-REX, commencez par répartir les embryons injectés dans des boîtes de 10 centimètres.
Dans une pièce sombre avec lumière rouge, remplacez le milieu par 30 millilitres de HBSS à 10% avec ou sans une micromolaire de la sonde REX. Incuber les embryons à 28,5 degrés Celsius dans l’obscurité. 30 heures après la fécondation, remplacez le support dans l’obscurité.
Après avoir répété l’incubation et le remplacement du milieu deux fois, exposez les embryons à la lumière d’une lampe UV préchauffée tourbillonnant toutes les 30 secondes. Pour effectuer un test phénotypique, retirez les embryons non fécondés ou morts de la plaque contenant les embryons anesthésiés. À l’aide d’une pince tranchante, retirez le chorion des embryons.
Monter les embryons sur une plaque d’agarose 2% préparée avec un milieu HBSS à 10% et observer au stéréomicroscope. Utilisez ImageJ pour compter le nombre de neutrophiles et de macrophages de chaque poisson. Sélectionnez la sélection à main levée et encerclez le poisson entier, puis choisissez l’option Trouver des maxima pour compter les cellules fluorescentes Dans la présente étude, les embryons traités au Z-REX ont démontré une perte de neutrophiles et de macrophages.
Cet effet était absent dans les groupes non traités. La voie de signalisation de l’apoptose n’a pas été déclenchée dans le groupe Halo-P2A-Keap1, ce qui a entraîné des niveaux inchangés de macrophages et de neutrophiles. Des résultats similaires ont également été observés chez le mutant Halo-TEV-Keap1 qui n’a pas répondu à l’ENH.
Les analyses de PCR transcriptionnelles et quantitatives en temps réel ont montré une régulation négative des gènes liés au système immunitaire et une régulation positive des gènes antioxydants après Z-REX. La coloration par immunofluorescence a montré que la construction divisée P2A avait deux fois plus de marqueurs HA que la construction de fusion TeV, ce qui indique des niveaux d’expression similaires. Les niveaux d’expression du type sauvage et du type mutant Halo-TeV-Keap1 étaient également similaires.
Dans la lignée de rapporteurs de neutrophiles transgéniques traités par Z-REX, une colocalisation des neutrophiles et des caspases actives 3 a également été observée. Le plus important est d’avoir vos documents correctement configurés. Limiter améliorera vraiment vos résultats.
Nous avons adopté Z-REX, une idée de plate-forme de dépistage de drogues connue sous le nom de Localis-REX. Jusqu’à présent, aucune autre technique n’a permis d’obtenir une telle cartographie locale spécifique et réactive du ligand ou de la cible. Il nous a aidés à développer des candidats médicaments électrophiles pour le traitement du cancer du sein.
Compte tenu de l’importance croissante de la signalisation localisée dans de nombreux domaines, cancer, immunologie, vieillissement, etc., Z-Rex, le seul outil capable de cartographier les événements dirigés par ligand réactif localisé, promet d’aider de nombreux domaines.
