また、Z-REXを活用することで、研究者はゼブラフィッシュ幼生の生理的条件に近い特定のタンパク質と係合する特定の反応性リガンドに応答して個々のシグナル伝達応答がどのように変化するかを調査することができます。バルク用量反応性低分子のような従来の方法は、標的と毒性を引き起こし、リガンド標的特異性を制御できません。Z-REXは、特定のリガンドターゲットの関与を特定の表現型と高い時空間精度でリンクさせることができます。
最近、Z-REXによって発見された関連標的および経路である反応性代謝物HNEが、トリプルネガティブ乳がんに対する精密なアイソフォーム特異的キナーゼ阻害剤の開発をどのように可能にするかを示しました。新鮮な10%ハンクの平衡塩溶液またはHBSSで満たされた注入プレートの溝に胚を整列させることから始めます。針先を培地に浸し、必要に応じて注入パルスを適用して先端の気泡を除去します胚を注入するには、絨毛膜と卵黄嚢を一回の動きで貫通し、注入パルスを適用します。
他の胚を注入した後、噴出ボトルを使用して、新鮮なHBSS培地を含む新しいペトリ皿にそれらをすすぎます。注入されていない胚を別のプレートにプールします。Z-REX処理分析を行うには、注入した胚を10センチの皿に分配することから始めます。
赤色光のある暗い部屋で、REXプローブの1マイクロモルの有無にかかわらず、培地を30ミリリットルの10%HBSSと交換します。暗闇の中で摂氏28.5度で胚をインキュベートします。受精後30時間で、暗闇の中で培地を交換します。
インキュベーションと培地交換を2回繰り返した後、30秒ごとに渦巻く予熱したUVランプからの光に胚をさらします。表現型アッセイを行うには、麻酔をかけた胚を含むプレートから未受精または死んだ胚を取り出します。鋭い鉗子を使用して、胚の絨毛膜を取り除きます。
10%HBSS培地で調製した2%アガロースプレートに胚をマウントし、実体顕微鏡で観察します。ImageJを使用して、各魚の好中球とマクロファージ数を数えます。フリーハンドセレクションを選択し、魚全体を丸で囲んでから、オプション「マキシマを探す」を選択して蛍光細胞をカウントします 本研究では、Z-REX処理された胚は好中球とマクロファージの喪失を示しました。
この効果は未治療群ではなかった。アポトーシスシグナル伝達経路はHalo-P2A-Keap1群では引き起こされず、マクロファージと好中球のレベルが変化しませんでした。同様の結果は、HNEに応答しなかったHalo-TEV-Keap1変異体でも観察された。
転写およびリアルタイム定量PCR解析では、Z-REX後に免疫関連遺伝子のダウンレギュレーションと抗酸化遺伝子のアップレギュレーションが示されました。免疫蛍光染色は、P2AスプリットコンストラクトがTeV融合コンストラクトよりも2倍多くのHAタグを有し、同様の発現レベルを示すことを示した。野生型と変異型Halo-TeV-Keap1の発現量も同様であった。
Z-REX処理トランスジェニック好中球レポーター株では、好中球と活性カスパーゼ3の共局在も観察されました。最も重要なことは、ドキュメントを正しく設定することです。制限すると、結果が大幅に向上します。
私たちは、Localis-REXと呼ばれる薬物スクリーニングプラットフォームにアイデアであるZ-REXを採用しました。これまでのところ、このような局所特異的で反応性のリガンドまたはターゲットマッピングを達成することができた技術は他にありません。乳がん治療に向けた求電子薬候補の開発に役立っています。
がん、免疫学、老化など、多くの分野にわたる局在性シグナル伝達の重要性が高まっていることを考えると、局所的な反応性リガンド指向性イベントをマッピングできる唯一のツールであるZ-Rexは、多くの分野を支援することを約束します。
