Таким образом, используя Z-REX, исследователи могут исследовать, как изменяются отдельные сигнальные реакции в ответ на специфический реактивный лиганд, взаимодействующий со специфическим белком, представляющим интерес в близких к физиологическим условиях у личинок рыбок данио. Традиционные методы, такие как реактивные малые молекулы в больших дозах, вызывают мишени и токсичность, и не дают контроля над специфичностью мишени для лигандов. Z-REX может связывать конкретное взаимодействие мишени лиганда с конкретным фенотипом с высокой пространственно-временной точностью.
Недавно мы показали, как реактивный метаболит HNE, ассоциированная мишень и путь, обнаруженный Z-REX, позволяет разрабатывать прецизионные ингибиторы изоформ-специфической киназы против тройного негативного рака молочной железы. Начните с выравнивания эмбрионов в канавках инъекционной пластины, заполненной свежим 10%-ным сбалансированным солевым раствором Хэнка или HBSS. Погрузите кончик иглы в среду и, при необходимости, примените импульсы инъекции для удаления пузырьков воздуха в наконечнике Для инъекции эмбриона одним движением проникните в хорион и желточный мешок и примените импульс инъекции.
После инъекции других эмбрионов промойте их в новую чашку Петри, содержащую свежую среду HBSS, с помощью бутылки для брызг. Объедините неинъецированные эмбрионы в другую пластину. Чтобы выполнить анализ лечения Z-REX, начните с распределения введенных эмбрионов в 10-сантиметровые чашки.
В темной комнате с красным светом замените среду на 30 миллилитров 10% HBSS с одним микромоляром датчика REX или без него. Инкубируйте эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия в темноте. Через 30 часов после оплодотворения замените носитель в темноте.
После повторения инкубации и замены среды дважды подвергните эмбрионы воздействию света от предварительно нагретой УФ-лампы, вращающейся каждые 30 секунд. Чтобы выполнить фенотипический анализ, удалите неоплодотворенные или мертвые эмбрионы из пластины, содержащей анестезированные эмбрионы. С помощью острых щипцов удаляют хорион эмбрионов.
Установите эмбрионы на 2%-ную агарозную пластину, приготовленную с 10%-ной средой HBSS, и наблюдайте под стереомикроскопом. Используйте ImageJ для подсчета количества нейтрофилов и макрофагов у каждой рыбы. Выберите «Выбор от руки» и обведите всю рыбу, затем выберите опцию «Найти максимумы», чтобы подсчитать флуоресцентные клетки В настоящем исследовании эмбрионы, обработанные Z-REX, продемонстрировали потерю нейтрофилов и макрофагов.
Этот эффект отсутствовал в группах, не получавших лечения. Сигнальный путь апоптоза не был запущен в группе Halo-P2A-Keap1, что привело к неизмененным уровням макрофагов и нейтрофилов. Аналогичные результаты также наблюдались у мутанта Halo-TEV-Keap1, который не реагировал на HNE.
Транскрипционный анализ и количественный ПЦР-анализ в реальном времени показали подавление генов, связанных с иммунитетом, и повышение регуляции антиоксидантных генов после Z-REX. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что P2A-расщепленная конструкция имела в два раза больше тегов HA, чем TeV-fusion-construct, что свидетельствует о сходных уровнях экспрессии. Уровни экспрессии дикого типа и мутантного типа Halo-TeV-Keap1 также были схожими.
В репортерной линии трансгенных нейтрофилов, обработанных Z-REX, также наблюдалась колокализация нейтрофилов и активной каспазы 3. Самое главное, чтобы ваши документы были правильно настроены. Ограничение действительно улучшит ваши результаты.
Мы внедрили Z-REX, идею платформы скрининга на наркотики, известной как Localis-REX. Ни один другой метод до сих пор не смог достичь такого локального специфического и реактивного лиганда или картирования мишеней. Это помогло нам разработать электрофильные препараты-кандидаты для лечения рака молочной железы.
Учитывая растущую важность локализованного сигнала во многих областях, раке, иммунологии, старении и т. д., Z-Rex, единственный инструмент, способный отображать локализованные события, направленные на реактивный лиганд, обещает помочь многим областям.
