Mit Hilfe von Z-REX können Forscher untersuchen, wie sich einzelne Signalantworten als Reaktion auf einen bestimmten reaktiven Liganden verändern, der unter physiologischen Bedingungen in Zebrafischlarven mit einem bestimmten Protein interagiert, das für nahe physiologische Bedingungen von Interesse ist. Konventionelle Methoden wie Bulk-Dosen reaktiver kleiner Moleküle, die Targets und Toxizität verursachen und keine Kontrolle über die Spezifität des Liganden-Targets ermöglichen. Z-REX kann ein spezifisches Liganden-Target-Engagement mit einem bestimmten Phänotyp mit hoher räumlich-zeitlicher Präzision verknüpfen.
Wir haben kürzlich gezeigt, wie ein reaktiver Metabolit HNE, ein assoziiertes Ziel und ein Signalweg, der von Z-REX entdeckt wurde, die Entwicklung von Präzisionsisoform-spezifischen Kinase-Inhibitoren gegen dreifach negative Brustkrebsarten ermöglicht. Beginnen Sie damit, die Embryonen in den Rillen einer Injektionsplatte auszurichten, die mit frischer 10%Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gefüllt ist. Tauchen Sie die Nadelspitze in das Medium und wenden Sie bei Bedarf Injektionsimpulse an, um Luftblasen in der Spitze zu entfernen Um den Embryo zu injizieren, dringen Sie mit einer einzigen Bewegung in das Chorion und den Dottersack ein und setzen Sie einen Injektionsimpuls ein.
Nachdem Sie die anderen Embryonen injiziert haben, spülen Sie sie mit einer Spritzflasche in eine neue Petrischale mit frischem HBSS-Medium. Fassen Sie die nicht injizierten Embryonen in einer anderen Platte zusammen. Um eine Analyse der Z-REX-Behandlung durchzuführen, verteilen Sie zunächst die injizierten Embryonen in 10-Zentimeter-Schalen.
Ersetzen Sie in einem dunklen Raum mit rotem Licht das Medium durch 30 Milliliter 10%HBSS mit oder ohne ein Mikromolar der REX-Sonde. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius im Dunkeln. Tauschen Sie 30 Stunden nach der Düngung das Medium im Dunkeln aus.
Nach zweimaliger Wiederholung der Inkubation und des zweimaligen Austauschs des Mediums werden die Embryonen dem Licht einer vorgewärmten UV-Lampe ausgesetzt, die alle 30 Sekunden wirbelt. Um einen phänotypischen Test durchzuführen, entfernen Sie die unbefruchteten oder toten Embryonen von der Platte, auf der sich die betäubten Embryonen befinden. Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette das Chorion der Embryonen.
Die Embryonen werden auf eine 2%Agaroseplatte gelegt, die mit 10%HBSS-Medium präpariert wurde, und unter einem Stereomikroskop betrachtet. Verwenden Sie ImageJ, um die Anzahl der Neutrophilen und Makrophagen jedes Fisches zu zählen. Wählen Sie die Freihandauswahl aus, umkreisen Sie den ganzen Fisch und wählen Sie dann die Option Maxima suchen, um die fluoreszierenden Zellen zu zählen In der vorliegenden Studie zeigten Z-REX-behandelte Embryonen einen Verlust von Neutrophilen und Makrophagen.
Dieser Effekt fehlte in den unbehandelten Gruppen. Der Apoptose-Signalweg wurde in der Halo-P2A-Keap1-Gruppe nicht ausgelöst, was zu unveränderten Makrophagen- und Neutrophilenspiegeln führte. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Halo-TEV-Keap1-Mutante beobachtet, die nicht auf die HNE reagierte.
Transkriptionelle und quantitative real-time PCR-Analysen zeigten eine Herunterregulierung immunrelevanter Gene und eine Hochregulation antioxidativer Gene nach Z-REX. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass das P2A-Split-Konstrukt doppelt so viele HA-Tags aufwies wie das TeV-Fusions-Konstrukt, was auf ähnliche Expressionsniveaus hindeutet. Auch die Expressionsniveaus des Wildtyps und des Mutantentyps Halo-TeV-Keap1 waren ähnlich.
In der Z-REX-behandelten transgenen Neutrophilen-Reporterlinie wurde auch eine Kolokalisation von Neutrophilen und aktiver Caspase 3 beobachtet. Das Wichtigste ist, dass Sie Ihre Dokumente richtig eingerichtet haben. Eine Begrenzung wird Ihre Ergebnisse wirklich verbessern.
Wir haben Z-REX, eine Idee, in eine Drogenscreening-Plattform namens Localis-REX übernommen. Keine andere Technik war bisher in der Lage, eine solche lokalspezifische und reaktive Liganden- oder Target-Kartierung zu erreichen. Es hat uns geholfen, elektrophile Wirkstoffkandidaten für die Behandlung von Brustkrebs zu entwickeln.
Angesichts der wachsenden Bedeutung lokalisierter Signalübertragung in vielen Bereichen, Krebs, Immunologie, Alterung usw., verspricht Z-Rex, das einzige Werkzeug, das in der Lage ist, die lokalisierten reaktiven Liganden-gerichteten Ereignisse zu kartieren, zahlreichen Bereichen zu helfen.
