유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

따라서 연구자들은 Z-REX를 활용하여 제브라피쉬 유충의 생리학적 조건에 가까운 특정 관심 단백질과 결합하는 특정 반응성 리간드에 대한 반응으로 개별 신호 반응이 어떻게 변경되는지 조사할 수 있습니다. 대량 투여 반응성 소분자와 같은 기존의 방법은 표적 및 독성을 유발하고 리간드 표적 특이성을 제어하지 않습니다. Z-REX는 높은 시공간 정밀도로 특정 리간드 표적 결합을 특정 표현형과 연결할 수 있습니다.

우리는 최근 Z-REX가 발견한 관련 표적 및 경로인 반응성 대사산물 HNE가 삼중 음성 유방암에 대한 정밀 동형 특이적 키나아제 억제제의 개발을 가능하게 하는 방법을 보여주었습니다. 신선한 10%Hank's balanced salt 용액 또는 HBSS로 채워진 주입 플레이트의 홈에 배아를 정렬하는 것으로 시작합니다. 바늘 끝을 배지에 담그고 필요한 경우 주입 펄스를 적용하여 팁의 기포를 제거합니다. 배아를 주입하려면 융모막과 난황낭을 한 번에 관통하고 주입 펄스를 적용합니다.

다른 배아를 주입한 후 물병을 사용하여 신선한 HBSS 배지가 들어 있는 새 페트리 접시에 헹굽니다. 주입되지 않은 배아를 다른 접시에 모으십시오. Z-REX 처리 분석을 수행하려면 먼저 주입된 배아를 10cm 접시에 분배합니다.

적색광이 있는 어두운 방에서 REX 프로브 1마이크로몰을 사용하거나 사용하지 않고 30밀리리터의 10% HBSS로 매체를 교체합니다. 어둠 속에서 섭씨 28.5도에서 배아를 배양하십시오. 수정 후 30 시간이 지나면 어둠 속에서 배지를 교체하십시오.

배양과 배지 교체를 두 번 반복한 후 30초마다 소용돌이치는 예열된 UV 램프의 빛에 배아를 노출시킵니다. 표현형 분석을 수행하려면 마취된 배아가 들어 있는 플레이트에서 수정되지 않았거나 죽은 배아를 제거합니다. 날카로운 집게를 사용하여 배아의 chorion을 제거하십시오.

10% HBSS 배지로 준비된 2% 아가로스 플레이트에 배아를 장착하고 실체 현미경으로 관찰합니다. ImageJ를 사용하여 각 물고기의 호중구와 대식세포 수를 계산합니다. 자유형 선택을 선택하고 전체 물고기에 동그라미를 친 다음 최대값 찾기 옵션을 선택하여 형광 세포를 계산합니다. 본 연구에서, Z-REX-처리된 배아는 호중구 및 대식세포의 손실을 입증하였다.

이 효과는 치료되지 않은 그룹에서는 나타나지 않았다. 세포자멸사 신호전달 경로는 Halo-P2A-Keap1 그룹에서 촉발되지 않아 대식세포 및 호중구 수준이 변경되지 않았습니다. HNE에 반응하지 않은 Halo-TEV-Keap1 돌연변이에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다.

전사 및 실시간 정량적 PCR 분석은 Z-REX 후 면역 관련 유전자의 하향 조절 및 항산화 유전자의 상향 조절을 보여주었습니다. 면역형광 염색은 P2A-분할-구축물이 TeV-융합-구축물보다 2배 더 많은 HA 태그를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 유사한 발현 수준을 나타낸다. 야생형 및 돌연변이형 Halo-TeV-Keap1의 발현 수준도 유사하였다.

Z-REX 처리된 형질전환 호중구 리포터 라인에서, 호중구 및 활성 카스파아제 3의 공동 국소화가 또한 관찰되었다. 가장 중요한 것은 문서를 올바르게 설정하는 것입니다. 제한하면 결과가 실제로 향상됩니다.

우리는 Localis-REX로 알려진 약물 스크리닝 플랫폼에 대한 아이디어인 Z-REX를 채택했습니다. 지금까지 다른 어떤 기술도 이러한 국소 특이적 및 반응성 리간드 또는 표적 맵핑을 달성할 수 없었습니다. 유방암 치료를 위한 친전자성 약물 후보를 개발하는 데 도움이 되었습니다.

암, 면역학, 노화 등 많은 분야에서 국소 신호 전달의 중요성이 커짐에 따라 국소 반응성 리간드 유도 이벤트를 매핑할 수 있는 유일한 도구인 Z-Rex는 다양한 분야에 도움이 될 것을 약속합니다.