E assim alavancando Z-REX, os pesquisadores podem interrogar como as respostas individuais da sinalização são alteradas em resposta a um ligante reactivo específico que se envolve com uma proteína específica do interesse em condições fisiológicas próximas em larvas de peixe-zebra. Métodos convencionais como pequenas moléculas reativas de dose em massa causam alvos e toxicidade e não dão controle sobre a especificidade do alvo do ligante. O Z-REX pode ligar um ligante específico com um fenótipo específico com alta precisão espaço-temporal.
Recentemente, mostramos como um metabólito reativo HNE, um alvo associado e uma via descoberta pelo Z-REX, permite o desenvolvimento de inibidores de quinase específicos de isoformas de precisão contra cânceres de mama triplo-negativos. Comece alinhando os embriões nos sulcos de uma placa de injeção preenchida com solução salina balanceada de Hank a 10% ou HBSS. Submergir a ponta da agulha no meio e, se necessário, aplicar pulsos de injeção para remover bolhas de ar na ponta Para injetar o embrião, penetre no córion e no saco vitelínico em um único movimento e aplique um pulso de injeção.
Depois de injetar os outros embriões, lave-os em uma nova placa de Petri contendo meios HBSS frescos usando um frasco de esguicho. Junte os embriões não injetados em outra placa. Para realizar a análise do tratamento Z-REX, comece distribuindo os embriões injetados em placas de 10 centímetros.
Em sala escura com luz vermelha, substituir o meio por 30 mililitros de HBSS 10% com ou sem um micromolar da sonda ROX. Incubar os embriões a 28,5 graus Celsius no escuro. Às 30 horas após a fecundação, substitua o meio no escuro.
Depois de repetir a incubação e a substituição do meio duas vezes, exponha os embriões à luz de uma lâmpada UV pré-aquecida girando a cada 30 segundos. Para realizar um ensaio fenotípico, remova os embriões não fertilizados ou mortos da placa que contém os embriões anestesiados. Usando pinças afiadas, remova o córion dos embriões.
Montar os embriões em placa de agarose a 2% preparada com meio HBSS a 10% e observar em estereomicroscópio. Use o ImageJ para contar o número de neutrófilos e macrófagos de cada peixe. Selecione a Seleção à mão livre e circule o peixe inteiro e, em seguida, escolha a opção Encontrar Maxima para contar as células fluorescentes No presente estudo, embriões tratados com Z-REX demonstraram perda de neutrófilos e macrófagos.
Esse efeito foi ausente nos grupos não tratados. A via de sinalização da apoptose não foi desencadeada no grupo Halo-P2A-Keap1, resultando em níveis inalterados de macrófagos e neutrófilos. Resultados semelhantes também foram observados no mutante Halo-TEV-Keap1 que não respondeu ao HNE.
Análises de PCR quantitativas transcricionais e em tempo real mostraram downregulation de genes relacionados à imunidade e upregulation de genes antioxidantes após Z-REX. A coloração por imunofluorescência mostrou que o constructo P2A-split-construct tinha duas vezes mais tags HA do que o TeV-fusion-construct, indicativo de níveis de expressão semelhantes. Os níveis de expressão do tipo selvagem e mutante Halo-TeV-Keap1 também foram semelhantes.
Na linhagem repórter de neutrófilos transgênicos tratados com Z-REX, também foi observada colocalização de neutrófilos e caspase 3 ativa. O mais importante é ter seus documentos configurados corretamente. Limitar vai realmente melhorar seus resultados.
Adotamos o Z-REX, uma ideia para uma plataforma de triagem de medicamentos conhecida como Localis-REX. Nenhuma outra técnica até o momento foi capaz de alcançar um mapeamento de ligante ou alvo local específico e reativo. Ele nos ajudou a desenvolver candidatos a drogas eletrofílicas para o tratamento do câncer de mama.
Dada a crescente importância da sinalização localizada em muitos campos, câncer, imunologia, envelhecimento, etc., o Z-Rex, a única ferramenta capaz de mapear os eventos direcionados ao ligante reativo localizado, promete ajudar vários campos.
