E così, sfruttando Z-REX, i ricercatori possono interrogarsi su come le risposte di segnalazione individuali sono alterate in risposta a uno specifico ligando reattivo che si impegna con una specifica proteina di interesse in condizioni quasi fisiologiche nelle larve di zebrafish. I metodi convenzionali come la dose massiva di piccole molecole reattive che causano bersagli e tossicità e non danno alcun controllo sulla specificità del bersaglio del ligando. Z-REX può collegare uno specifico ligando target engagement con uno specifico fenotipo con elevata precisione spaziotemporale.
Abbiamo recentemente dimostrato come un metabolita reattivo HNE, un bersaglio associato e un pathway scoperto da Z-REX, consente lo sviluppo di inibitori chinasi isoform-specifici di precisione contro i tumori della mammella triplo negativi. Iniziare allineando gli embrioni nelle scanalature di una piastra di iniezione riempita con soluzione salina bilanciata fresca al 10% di Hank o HBSS. Immergere la punta dell'ago nel mezzo e, se necessario, applicare impulsi di iniezione per rimuovere le bolle d'aria nella punta Per iniettare l'embrione, penetrare nel corion e nel sacco vitellino in una sola mossa e applicare un impulso di iniezione.
Dopo aver iniettato gli altri embrioni, sciacquarli in una nuova capsula di Petri contenente terreni HBSS freschi utilizzando un flacone a spruzzo. Raggruppare gli embrioni non iniettati in un'altra piastra. Per eseguire l'analisi del trattamento Z-REX, iniziare distribuendo gli embrioni iniettati in piatti di 10 centimetri.
In una stanza buia con luce rossa, sostituire il mezzo con 30 millilitri di 10% HBSS con o senza un micromolare della sonda REX. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius al buio. A 30 ore dopo la fecondazione, sostituire i terreni al buio.
Dopo aver ripetuto due volte l'incubazione e la sostituzione dei supporti, esporre gli embrioni alla luce di una lampada UV preriscaldata che turbina ogni 30 secondi. Per eseguire un test fenotipico, rimuovere gli embrioni non fecondati o morti dalla piastra contenente gli embrioni anestetizzati. Usando una pinza affilata, rimuovere il corion degli embrioni.
Montare gli embrioni su una piastra di agarosio al 2% preparata con il 10% di terreno HBSS e osservarli sotto uno stereomicroscopio. Usa ImageJ per contare il numero di neutrofili e macrofagi di ciascun pesce. Seleziona la selezione a mano libera e cerchia l'intero pesce, quindi scegli l'opzione Trova Maxima per contare le cellule fluorescenti Nel presente studio, gli embrioni trattati con Z-REX hanno dimostrato una perdita di neutrofili e macrofagi.
Questo effetto era assente nei gruppi non trattati. La via di segnalazione dell'apoptosi non è stata attivata nel gruppo Halo-P2A-Keap1 con conseguente inalterazione dei livelli di macrofagi e neutrofili. Risultati simili sono stati osservati anche nel mutante Halo-TEV-Keap1 che non ha risposto alla HNE.
Le analisi quantitative della PCR trascrizionale e in tempo reale hanno mostrato una downregulation dei geni immuno-correlati e una sovraregolazione dei geni antiossidanti dopo Z-REX. La colorazione a immunofluorescenza ha mostrato che il costrutto P2A-split-construct aveva due volte più tag HA rispetto al costrutto di fusione TeV, indicativo di livelli di espressione simili. Anche i livelli di espressione del tipo selvatico e del tipo mutante Halo-TeV-Keap1 erano simili.
Nella linea reporter di neutrofili transgenici trattati con Z-REX, è stata osservata anche la colocalizzazione dei neutrofili e della caspasi attiva 3. La cosa più importante è avere i tuoi documenti impostati correttamente. Limitare migliorerà davvero i tuoi risultati.
Abbiamo adottato Z-REX, un'idea per una piattaforma di screening dei farmaci nota come Localis-REX. Nessun'altra tecnica finora è stata in grado di ottenere una mappatura del ligando o del bersaglio così specifica e reattiva locale. Ci ha aiutato a sviluppare candidati farmaci elettrofili per il trattamento del cancro al seno.
Data la crescente importanza della segnalazione localizzata in molti campi, cancro, immunologia, invecchiamento, eccetera, Z-Rex, l'unico strumento in grado di mappare gli eventi localizzati diretti dal ligando reattivo, promette di aiutare numerosi campi.
