该方法使用用镓-68标记的D-肽DPA。用于标记 DPA 的无线电示踪剂 Gallium-68 能够以非侵入性方式实时可视化全身 PDL-1 表达。D-肽的使用使放射性示踪剂对蛋白水解降解具有超强的抵抗力，并显着延长了其代谢半衰期。
特别是，该技术可用于评估不同的疾病，通过发现特定目标和开发具有良好电话动力学的无线电示踪剂。该技术还可用于治疗 PDL-1 阳性肿瘤，同时用其他放射性核苷酸（如镥-177 和锕-225）标记 DPA。演示该程序的将是我实验室的研究员Wu 江。
为了放射性标记肽 d-十二肽拮抗剂或 DPA，将 5 μL 制备的含有 DPA 的储备缓冲液移液到带螺旋盖的 1.5 毫升聚丙烯容器中，并向容器中加入 400 微升 68 三氯化镓。将混合物涡旋五秒钟。使用pH试纸测量混合物的pH值，并用0.1摩尔氢氧化钠将pH值调节至4至4.5。
将溶液在室温下孵育 5 至 10 分钟。然后按照文中提到的条件，将反应混合物置于放射性HPLC中以分析放射性标记产率。为了测试 PBS 中的示踪剂稳定性，将 10 μL 镓 68 标记的 DPA 在乙酸钠溶液中加入 990 μL PBS 中。
将混合物在 37 摄氏度下孵育 1、2 和 4 小时，并轻轻搅拌。在每个所述时间点收集200微升溶液，并通过无线电HPLC进行分析。为了测试小鼠血清中的示踪剂稳定性，将 10 μL 镓 68 标记的 DPA 在醋酸钠溶液中加入 90 μL 新鲜制备的小鼠血清中，并将混合物在 37 摄氏度下孵育 1、2 和 4 小时，轻微搅拌。
然后在每个所述时间点收集 20 微升溶液，并将 100 微升乙酰丁腈水混合物加入收集的等分试样中。在25摄氏度下以5,000G离心混合物10分钟。使用放射性HPLC分析上清液。
在 12 孔板中培养 U-87 MG 细胞，直至达到 80% 汇合度。然后取出培养基并用0.5毫升PBS洗涤细胞。在新鲜培养基中将镓-68标记的DPA稀释至每毫升74千贝克勒尔的浓度。
然后向每个孔中加入 0.5 毫升稀释的镓 68 标记的 DPA 缓冲液。在 37 摄氏度下用镓 68 标记的 DPA 孵育细胞，持续 10、30、40 和 120 分钟。孵育后，使用移液管吸出培养基，并用0.5毫升PBS洗涤细胞三次。
接下来，每孔加入 300 微升 0.5 摩尔氢氧化钠溶液以裂解细胞。30秒后，将粘性细胞裂解物收集在1.5毫升管中。通过每孔两次加入0.4毫升PBS来清洗板，并将洗涤液收集在上述1.5毫升管中。
启动自动伽马计数器的内置计算机，将试管放入内置架子中。将所有样品装载到传送带上后，按下开始按钮。结果在内部软件中计算，而读数则记录每根试管每分钟的衰减相关计数或 CPM。
按照文中提到的方案收集U-87 MG细胞，并将细胞吸入0.5毫升注射器中。接下来，取BALB / c裸鼠并皮下注射细胞，保持每只小鼠两个肿瘤的计数。注射后监测肿瘤生长，直到肿瘤体积达到100至300立方毫米。
要进行 PET 成像，请通过预装的尾静脉导管静脉注射示踪剂。使用参考软件在主机中创建扫描工作流程，然后根据制造商的指南创建研究文件夹并设置采集方案。在 3D 列表模式下对每只鼠标执行动态扫描 60 分钟。
接下来，按照制造商的说明定义直方图协议和重建协议。使用每像素 0.5 个周期的奈奎斯特截止值的 Hanning 滤镜重建 PET 动态图像 25 到 30 分钟，并通过滤波后背投影重建 55 到 60 分钟。为所有小鼠生成最大强度投影或MIP图像。
通过尾静脉注射将镓-68标记的DPA施用到携带BALB / c的U-87 MG裸鼠。安乐死后，解剖动物的胸壁并打开心脏。使用一毫升注射器抽血并将血液从注射器中挤压到放射免疫测定管或 RIA 中，伽马计数器的直径为 13 毫米。
切除主要器官和肿瘤，并将它们放入类似的 RIA 管中用于伽马计数器。称量经文中提到的所有主要器官。使用自动伽马计数器测量收集器官内的放射性，并对值进行衰减校正。
计算每克湿组织的注射剂量百分比。镓-68标记的DPA显示出高放射性化学产率杂质。它在 PBS 和小鼠血清中都高度稳定，孵育 4 小时后未发现镓 68 分解或肽水解。
通过流式细胞术发现大约 60% 的 U-87 MG 细胞被编程为死亡配体 1 或 PDL-1 阳性，免疫荧光染色证实了 U-87 MG 细胞中 PDL-1 的强表达。U-87 MG 细胞显示出镓 68 标记的 DPA 的时间依赖性摄取，在使用 PDL-1 抑制剂 BMS-202 作为阻断剂后，DPA 显着降低。当使用镓-68标记的DPA作为竞争对手时，BMS-202的估计结合亲和力为每升43.8纳摩尔。
全身PET图像显示，注射30分钟和60分钟后，肿瘤中镓-68标记的DPA积累量很高。一项平行实验表明，在注射后 60 分钟，阴性对照 Bon-1 肿瘤中镓 68 标记的 DPA 积累很少。此外，免疫组织化学染色显示 U-87 MG 细胞呈现出相当高的 PDL-1 表达，但 Bon-1 肿瘤没有。
苏木精和伊红染色显示两种肿瘤组织之间的细胞形态相似。离体生物分布研究显示，在大多数分析的器官中，包括心脏、肝脏、肺和肌肉，放射性和血液都能迅速清除。肾脏积累的放射性量最高，而肿瘤在所有时间点都表现出第二高的示踪剂摄取。
使用用镓-68标记DPA的有效方法是D肽的结构不同，这是最重要的一步。该技术为利用PET测试作为有效的放射性药物来管理不同的癌症铺平了道路，既可以作为PET示踪剂，也可以作为放射诊断剂。
