Bu yöntem, Galyum-68 ile etiketlenmiş D-peptid DPA'yı kullanır. DPA'yı etiketlemek için radyo izleyici Galyum-68, tüm vücutta PDL-1 ekspresyonunun invaziv olmayan bir şekilde gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar. D-peptid kullanımı, radyo izleyiciye proteolitik bozulmaya karşı hiper direnç kazandırır ve metabolik yarı ömürlerini önemli ölçüde uzatır.
Özellikle, teknik, belirli hedeflerin keşfine ve iyi telefon görüşmesi kinetiğine sahip radyo izleyicilerinin geliştirilmesine tabi tutulan farklı hastalıkları değerlendirmek için uygulanabilir. Teknik, DPA'yı Lutesyum-177 ve Aktinyum-225 gibi diğer radyo nükleotidleri ile etiketlerken PDL-1 pozitif tümörlerin tedavisine de uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırmacı olan Wu Jiang olacak.
Peptit d-dodekapeptid antagonisti veya DPA'nın radyo-işaretlemesi için, DPA içeren hazırlanmış stok tamponunun beş mikrolitresini vidalı kapaklı 1.5 mililitrelik bir polipropilen kaba pipetleyin ve kaba 400 mikrolitre 68 galyum triklorür ekleyin. Karışımı beş saniye boyunca vorteksleyin. pH test şeritleri kullanarak karışımın pH'ını ölçün ve pH'ı 0,1 molar sodyum hidroksit ile 4 ila 4,5'e ayarlayın.
Çözeltiyi oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. Ardından, metinde belirtilen koşulları izleyerek, radyoetiketleme verimini analiz etmek için reaksiyon karışımını radyo HPLC'ye tabi tutun. PBS'deki izleyici stabilitesini test etmek için, 990 mikrolitre PBS'ye sodyum asetat çözeltisi içinde 10 mikrolitre Galyum-68 etiketli DPA ekleyin.
Karışımı 37 santigrat derecede bir, iki ve dört saat boyunca hafif çalkalayarak inkübe edin. Belirtilen her zaman noktasında 200 mikrolitre çözelti toplayın ve radyo HPLC ile analiz edin. Fare serumundaki izleyici stabilitesini test etmek için, taze hazırlanmış fare serumunun 90 mikrolitresine sodyum asetat çözeltisi içinde 10 mikrolitre Galyum-68 etiketli DPA ekleyin ve karışımı hafif çalkalama ile bir, iki ve dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra belirtilen her zaman noktasında 20 mikrolitre çözelti toplayın ve toplanan alikotun içine 100 mikrolitre aseto nitril su karışımı ekleyin. Karışımı 5.000 G'de 25 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı radyo HPLC kullanarak analiz edin.
U-87 MG hücrelerini% 80 birleşmeye ulaşılana kadar 12 oyuklu plakalarda kültürleyin. Sonra ortamı çıkarın ve hücreleri 0,5 mililitre PBS ile yıkayın. Galyum-68 etiketli DPA'yı taze ortamda mililitre başına 74 kilobekerel konsantrasyonuna seyreltin.
Ardından her bir oyuğa 0,5 mililitre seyreltilmiş Galyum-68 etiketli DPA tamponu ekleyin. Hücreleri Galyum-68 etiketli DPA ile 37, 10, 30 ve 40 dakikalık süreler boyunca 120 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon sonrası, ortamı bir pipet kullanarak aspire edin ve hücreleri üç kez 0,5 mililitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra, hücreleri parçalamak için oyuk başına 300 mikrolitre 0.5 molar sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin. 30 saniye sonra, viskoz hücre lizatlarını 1.5 mililitrelik tüplerde toplayın. Plakayı iki kez oyuk başına 0.4 mililitre PBS ekleyerek yıkayın ve yıkama solüsyonunu belirtilen 1.5 mililitrelik tüplerde toplayın.
Otomatik gama sayacının yerleşik bilgisayarını başlatın ve tüpleri yerleşik rafa yerleştirin. Tüm numuneleri konveyöre yükledikten sonra, başlat düğmesine basın. Sonuçlar dahili yazılımda hesaplanırken, okuma, her bir tüpün dakika başına bozunma ile ilişkili sayımlarını veya CPM'yi kaydeder.
Metinde belirtilen protokolü izleyerek U-87 MG hücrelerini toplayın ve hücreleri 0.5 mililitrelik bir şırıngaya aspire edin. Daha sonra, BALB / c Nude fareleri alın ve fare başına iki tümör sayısını koruyarak hücreleri deri altına enjekte edin. Tümör hacmi 100 ila 300 milimetre küp olana kadar enjeksiyondan sonra tümör büyümesini izleyin.
PET görüntüleme yapmak için, izleyicileri önceden takılmış bir kuyruk ven kateteri aracılığıyla intravenöz olarak enjekte edin. Referans yazılımı kullanarak bir ana bilgisayarda bir tarama iş akışı oluşturun, ardından bir çalışma klasörü oluşturun ve üreticinin yönergelerine göre alım protokolünü ayarlayın. 3D liste modunda 60 dakika boyunca her farede dinamik taramalar gerçekleştirin.
Ardından, üreticinin talimatını izleyerek bir histogram protokolü ve bir yeniden yapılandırma protokolü tanımlayın. PET dinamik görüntülerini 25 ila 30 dakika ve filtrelenmiş geri projeksiyon yoluyla 55 ila 60 dakika boyunca yeniden oluşturmak için piksel başına 0,5 döngülük bir Nyquist kesme ile Hanning'in filtresini kullanın. Tüm fareler için maksimum yoğunluk projeksiyonu veya MIP görüntüleri oluşturun.
Galyum-68 etiketli DPA'yı U-87 MG taşıyan BALB/c Nude farelere kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla uygulayın. Ötenaziden sonra, hayvanın göğüs duvarını inceleyin ve kalbi açın. Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, kan alın ve kanı şırıngadan gama sayacı için çapı 13 milimetre olan bir radyo immünoassay tüpüne veya RIA'ya sıkın.
Ana organları ve tümörleri çıkarın ve gama sayacı için benzer RIA tüplerine yerleştirin. Metinde bahsedilen tüm ana organları tartın. Bir otomatik gama sayacı kullanarak toplanan organlardaki radyoaktiviteyi ölçün ve değerleri bozundurun.
Islak doku gramı başına enjekte edilen dozun yüzdesini hesaplayın. Galyum-68 etiketli DPA, yüksek radyo kimyasal verim safsızlığı gösterdi. Hem PBS hem de fare serumunda oldukça stabildi ve dört saatlik inkübasyondan sonra Galyum-68 ayrışması veya peptit hidrolizi göstermedi.
U-87 MG hücrelerinin yaklaşık% 60'ının, akış sitometrisi ile ölüm ligandına veya PDL-1 pozitifine programlandığı bulundu ve immünofloresan boyama, U-87 MG hücrelerinde PDL-1'in güçlü ekspresyonunu doğruladı. U-87 MG hücreleri, bir bloke edici ajan olarak bir PDL-1 inhibitörü olan BMS-202 kullanıldığında önemli ölçüde azalan Galyum-68 etiketli DPA'nın zamana bağlı bir alımını gösterdi. BMS-202 için tahmini bağlanma afinitesi, Galyum-68 etiketli DPA rakip olarak kullanıldığında litre başına 43.8 nanomol idi.
Tüm vücut PET görüntüleri, enjeksiyondan 30 ve 60 dakika sonra tümörde yüksek Galyum-68 etiketli DPA birikimi olduğunu ortaya koydu. Paralel bir deney, enjeksiyondan 60 dakika sonra negatif kontrol Bon-1 tümörlerinde çok az Galyum-68 etiketli DPA birikimi gösterdi. Ayrıca, immünohistokimyasal boyama, U-87 MG hücrelerinin önemli ölçüde PDL-1 ekspresyonu sunduğunu, ancak Bon-1 tümörü olmadığını ortaya koydu.
Hematoksilen ve eozin boyaması, iki tümör dokusu arasında benzer bir hücre morfolojisi gösterdi. Ex-vivo biyo-dağıtım çalışması, kalp, karaciğer, akciğer ve kas dahil olmak üzere analiz edilen organların çoğunda radyoaktivite ve kanın hızlı bir şekilde temizlendiğini gösterdi. Böbrek en yüksek miktarda radyoaktivite biriktirirken, tümör tüm zaman noktalarında ikinci en yüksek izleyici alımını sergiledi.
DPA'yı Galyum-68 ile etiketlemek için etkili bir yöntem kullanılarak D-peptidin yapısının farklı olması en önemli adımdır. Bu teknik, PET testinin hem PET izleyicileri hem de radyo teşhis ajanları olarak farklı kanserleri yönetmek için etkili radyo farmasötikleri olarak kullanılmasının yolunu açtı.
