この分析法では、ガリウム-68 で標識された D-ペプチド DPA を使用します。DPAを標識する無線トレーサーGallium-68は、全身のPDL-1発現を非侵襲的にリアルタイムに可視化することを可能にします。Dペプチッドの使用は蛋白質分解の低下に対してhyper-resistantの無線トレーサーを、非常に新陳代謝の半減期を延長する与える。
特に、この技術は、特定の標的の発見や、良好な電話速度論を有する無線トレーサーの開発に服従する、異なる疾患の評価に適用することができる。この技術は、ルテチウム-177やアクチニウム-225などの他の無線ヌクレオチドでDPAを標識しながら、PDL-1陽性腫瘍の治療にも適用できます。手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるWu Jiangです。
ペプチドd-ドデカペプチド拮抗薬(DPA)を放射性標識するには、DPAを含む調製したストックバッファー5マイクロリットルをスクリューキャップ付きの1.5ミリリットルのポリプロピレン容器にピペットで移し、400マイクロリットルの68三塩化ガリウムを容器に加えます。混合物を5秒間ボルテックスします。pHテストストリップを使用して混合物のpHを測定し、0.1モルの水酸化ナトリウムでpHを4〜4.5に調整します。
溶液を室温で5〜10分間インキュベートします。次に、本文に記載されている条件に従って、反応混合物を無線HPLCにかけ、放射性標識収率を分析します。PBSのトレーサー安定性をテストするには、990マイクロリットルのPBSに酢酸ナトリウム溶液中の10マイクロリットルのガリウム-68標識DPAを加えます。
混合物を摂氏37度で1時間、2時間、および4時間、わずかに攪拌しながらインキュベートします。上記の各時点で200マイクロリットルの溶液を収集し、無線HPLCで分析します。マウス血清中のトレーサーの安定性をテストするには、調製したばかりのマウス血清90マイクロリットルに酢酸ナトリウム溶液中の10マイクロリットルのガリウム-68標識DPAを加え、混合物を摂氏37度で1時間、2時間、および4時間、わずかな攪拌でインキュベートします。
次に、上記の各時点で20マイクロリットルの溶液を収集し、収集したアリコートに100マイクロリットルのアセトニトリル水混合物を追加します。混合物を5, 000 Gで25°Cで10分間遠心分離します。無線HPLCを用いて上清を分析します。
U-87 MG細胞を12ウェルプレートで80%のコンフルエントに達するまで培養します。次に培地を取り除き、0.5ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。ガリウム-68標識DPAを新鮮な培地で74キロベクレル/ミリリットルの濃度に希釈します。
次に、0.5 mLの希釈ガリウム-68標識DPAバッファーを各ウェルに添加します。細胞をガリウム-68標識DPAと摂氏37度で10分、30分、40分、120分インキュベートします。インキュベーション後、ピペットを使用して培地を吸引し、0.5ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。
次に、ウェルあたり300マイクロリットルの0.5モルの水酸化ナトリウム溶液を添加して、細胞を溶解します。30秒後、粘性細胞ライセートを1.5ミリリットルのチューブに集めます。ウェルあたり0.4ミリリットルのPBSを2回加えてプレートを洗浄し、前述の1.5ミリリットルのチューブに洗浄液を回収します。
自動ガンマカウンターの内蔵コンピュータを起動し、チューブを内蔵棚に入れます。すべてのサンプルをコンベアにセットしたら、スタートボタンを押します。結果は内部ソフトウェアで計算され、読み出しには各チューブの毎分減衰相関カウント(CPM)が記録されます。
本文に記載されているプロトコルに従ってU-87 MG細胞を採取し、細胞を0.5ミリリットルのシリンジに吸引します。次に、BALB/cヌードマウスを採取し、マウス1匹あたり2つの腫瘍の数を維持しながら、細胞を皮下注射します。腫瘍の体積が100〜300立方ミリメートルになるまで、注射後の腫瘍の成長を監視します。.
PETイメージングを実行するには、事前に取り付けられた尾静脈カテーテルからトレーサーを静脈内注射します。リファレンスソフトウェアを使用してホストコンピュータでスキャンワークフローを作成し、スタディフォルダを作成し、メーカーのガイドラインに従って取得プロトコルを設定します。3Dリストモードで各マウスの動的スキャンを60分間実行します。
次に、製造元の指示に従って、ヒストグラムプロトコルと再構成プロトコルを定義します。ピクセルあたり 0.5 サイクルのナイキスト カットオフで Hanning のフィルターを使用して、PET 動的画像を 25 分から 30 分間、フィルターをかけたバックプロジェクションで 55 分から 60 分再構成します。すべてのマウスの最大強度投影 (MIP) イメージを生成します。
尾静脈注射により、BALB/cヌードマウスを有するU-87 MGにガリウム-68標識DPAを投与する。安楽死後、動物の胸壁を解剖し、心臓を開きます。1ミリリットルの注射器を使用して採血し、注射器からガンマカウンター用の直径13ミリメートルのラジオイムノアッセイチューブ(RIA)に血液を絞ります。
主要な臓器と腫瘍を切除し、ガンマカウンター用の同様のRIAチューブに入れます。本文で言及されているすべての主要な臓器の重量を量ります。自動ガンマカウンターを使用して収集された臓器内の放射能を測定し、値を減衰補正します。
ウェットティッシュのグラムあたりの注射用量のパーセンテージを計算します。ガリウム-68標識DPAは、高い放射性化学収率不純物を示しました。PBSとマウス血清の両方で非常に安定しており、4時間のインキュベーション後にガリウム-68の分解やペプチドの加水分解は見られませんでした。
U-87 MG細胞の約60%は、フローサイトメトリーによりリガンド1死、またはPDL-1陽性にプログラムされていることが判明し、免疫蛍光染色により、U-87 MG細胞におけるPDL-1の強い発現が確認されました。U-87 MG細胞は、ガリウム-68標識DPAの経時的な取り込みを示し、PDL-1阻害剤であるBMS-202をブロッキング剤として使用すると有意に減少しました。BMS-202の推定結合親和性は、ガリウム-68標識DPAを競合製品として使用した場合、43.8ナノモル/リットルでした。
全身PET画像では、30分および60分の注射後に腫瘍に高いガリウム-68標識DPA蓄積が明らかになった。並行実験では、注射後60分でネガルピーコントロールのBon-1腫瘍にガリウム-68標識DPAがほとんど蓄積しないことが実証された。さらに、免疫組織化学的染色により、U-87 MG細胞はかなりのPDL-1発現を示したが、Bon-1腫瘍は示さなかったことが明らかになった。
ヘマトキシリン染色とエオシン染色では、2つの腫瘍組織間で同様の細胞形態が示されました。ex-vivo生体内分布研究では、心臓、肝臓、肺、筋肉など、分析されたほとんどの臓器で放射能と血液が急速に除去されることが示されました。腎臓は最も多くの放射能を蓄積し、腫瘍はすべての時点で2番目に高いトレーサー取り込みを示しました。
D-ペプチドの構造が異なることは、DPAをガリウム-68で標識するための効率的な方法を使用することが最も重要なステップです。この技術は、PETトレーサーと放射線診断薬の両方として、さまざまながんを管理するための効果的な放射性医薬品としてPET検査を利用する道を開きました。
