В этом методе используется D-пептид DPA, меченный галлием-68. Радиоиндикатор галлий-68 для маркировки DPA позволяет в режиме реального времени визуализировать экспрессию PDL-1 во всем организме неинвазивным способом. Использование D-пептида придает радиоиндикаторам гиперрезистентность к протеолитической деградации и значительно продлевает их метаболический период полувыведения.
В частности, методика может быть применена для оценки различных заболеваний, при условии обнаружения специфических мишеней и разработки радиоиндикаторов с хорошей кинетикой телефонного звонка. Метод также может быть применен для лечения PDL-1-положительных опухолей при мечении ДПА другими радионуклеотидами, такими как лютеций-177 и актиний-225. Продемонстрировать процедуру будет Ву Цзян, исследователь из моей лаборатории.
Для радиомечения антагониста пептида d-додекапептида (ДПА) пипеткой пять микролитров подготовленного исходного буфера, содержащего ДПА, в полипропиленовый контейнер объемом 1,5 миллилитра с завинчивающейся крышкой и добавьте в контейнер 400 микролитров трихлорида галлия 68. Перемешайте смесь в течение пяти секунд. Измерьте pH смеси с помощью тест-полосок pH и отрегулируйте pH до 4-4,5 с помощью 0,1 молярного гидроксида натрия.
Выдерживают раствор при комнатной температуре от пяти до 10 минут. Затем, следуя условиям, упомянутым в тексте, подвергают реакционную смесь радио-ВЭЖХ для анализа выхода радиоактивного мечения. Чтобы проверить стабильность индикатора в PBS, добавьте 10 микролитров меченого галлием-68 DPA в растворе ацетата натрия к 990 микролитрам PBS.
Выдерживайте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного, двух и четырех часов при легком перемешивании. Соберите 200 микролитров раствора в каждый указанный момент времени и проанализируйте его с помощью радиоВЭЖХ. Чтобы проверить стабильность индикатора в сыворотке крови мышей, добавьте 10 микролитров меченого галлием-68 DPA в растворе ацетата натрия к 90 микролитрам свежеприготовленной мышиной сыворотки и инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного, двух и четырех часов при легком перемешивании.
Затем соберите 20 микролитров раствора в каждый указанный момент времени и добавьте 100 микролитров смеси ацетонитрильной воды в собранную аликвоту. Центрифугируют смесь при 5 000 G в течение 10 минут при температуре 25 градусов Цельсия. Анализируют надосадочную жидкость с помощью радиоВЭЖХ.
Культивирование клеток U-87 MG в 12-луночных планшетах до достижения 80%-ного слияния. Затем удалите средство и промойте клетки 0,5 миллилитрами PBS. Разбавьте ДПА, меченный галлием-68, в свежей среде до концентрации 74 килобеккереля на миллилитр.
Затем добавьте в каждую лунку по 0,5 миллилитра разбавленного буфера DPA, меченного галлием-68. Инкубируйте клетки с меченым галлием-68 DPA при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10, 30, 40 и 120 минут. После инкубации аспирируйте среду с помощью пипетки и трижды промойте клетки 0,5 миллилитрами PBS.
Затем добавьте 300 микролитров 0,5 молярного раствора гидроксида натрия на лунку для лизировки клеток. Через 30 секунд соберите вязкие клеточные лизаты в пробирки объемом 1,5 миллилитра. Промойте пластину, добавив 0,4 миллилитра PBS на лунку дважды, и соберите промывочный раствор в упомянутые 1,5-миллилитровые пробирки.
Запустите встроенный компьютер автоматического гамма-счетчика и поместите пробирки во встроенную полку. После загрузки всех образцов на конвейер нажмите кнопку запуска. Результаты рассчитываются во внутреннем программном обеспечении, в то время как считывание записывает коррелированное количество затуханий в минуту (CPM) каждой трубки.
Соберите клетки U-87 MG в соответствии с протоколом, упомянутым в тексте, и аспирируйте клетки в шприц объемом 0,5 миллилитра. Затем возьмите мышей BALB/c Nude и введите клетки подкожно, поддерживая количество двух опухолей на мышь. Контролируйте рост опухоли после инъекции до тех пор, пока объем опухоли не составит от 100 до 300 кубических миллиметров.
Для проведения ПЭТ-визуализации индикаторы вводят внутривенно через предварительно установленный катетер для хвостовых вен. Создайте рабочий процесс сканирования на главном компьютере с помощью эталонного программного обеспечения, а затем создайте папку исследования и настройте протокол сбора данных в соответствии с рекомендациями производителя. Выполняйте динамическое сканирование каждой мыши в течение 60 минут в режиме 3D-списка.
Затем определите протокол гистограммы и протокол реконструкции, следуя инструкциям производителя. Используйте фильтр Хэннинга с отсечкой по Найквисту 0,5 цикла на пиксель для реконструкции динамических изображений ПЭТ в течение 25–30 минут и 55–60 минут с помощью обратной проекции с фильтром. Генерация проекции максимальной интенсивности (MIP) для всех мышей.
Вводят меченый галлием-68 DPA голым мышам U-87 MG с BALB/c через инъекцию в хвостовую вену. После эвтаназии препарируют грудную стенку животного и вскрывают сердце. Используя шприц объемом один миллилитр, возьмите кровь и выдавите кровь из шприца в пробирку для радиоиммуноанализа, или РИА, диаметром 13 миллиметров для гамма-счетчика.
Иссеките основные органы и опухоли и поместите их в аналогичные пробирки РИА для гамма-счетчика. Взвесьте все основные органы, упомянутые в тексте. Измерьте радиоактивность в собранных органах с помощью автоматического гамма-счетчика и скорректируйте значения.
Рассчитайте процент вводимой дозы на грамм влажной ткани. DPA, меченный галлием-68, показал высокую радиохимическую примесь. Он был очень стабилен как в PBS, так и в мышиной сыворотке, не показывая разложения галлия-68 или гидролиза пептидов после четырехчасовой инкубации.
Было обнаружено, что примерно 60% клеток U-87 MG были запрограммированы на смерть первого лиганда или PDL-1 положительным методом проточной цитометрии, а иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило сильную экспрессию PDL-1 в клетках U-87 MG. Клетки U-87 MG показали зависящее от времени поглощение меченого галлием-68 DPA, которое значительно снижалось при использовании ингибитора PDL-1, BMS-202, в качестве блокирующего агента. Предполагаемое сродство связывания BMS-202 составляло 43,8 наномоль на литр, когда в качестве конкурента использовался DPA, меченный галлием-68.
ПЭТ-изображения всего тела показали высокое накопление меченого галлием-68 DPA в опухоли через 30 и 60 минут после инъекции. Параллельный эксперимент продемонстрировал небольшое накопление ДПА, меченного галлием-68, в опухолях Bon-1 с отрицательным контролем через 60 минут после инъекции. Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание показало, что клетки U-87 MG демонстрировали значительную экспрессию PDL-1, но не опухоль Bon-1.
Окрашивание гематоксилином и эозином показало сходную морфологию клеток между двумя опухолевыми тканями. Исследование биораспределения ex-vivo показало быстрое очищение от радиоактивности и крови в большинстве анализируемых органов, включая сердце, печень, легкие и мышцы. Почка накапливала наибольшее количество радиоактивности, в то время как опухоль демонстрировала второе по величине поглощение индикаторов за все временные точки.
Наиболее важным этапом является изменение структуры D-пептида при использовании эффективного метода мечения ДПА с помощью галлия-68. Этот метод проложил путь к использованию ПЭТ-теста в качестве эффективных радиофармацевтических препаратов для лечения различных видов рака, как в качестве ПЭТ-индикаторов, так и в качестве средств радиодиагностики.
