Este método utiliza o peptídeo D DPA, marcado com Gálio-68. O radiotraçador Gálio-68 para marcar o DPA permite a visualização em tempo real da expressão de PDL-1 em todo o corpo de forma não invasiva. O uso do peptídeo D confere ao radiotraçador hiper-resistência à degradação proteolítica e prolonga notavelmente suas meias-vidas metabólicas.
Em particular, a técnica pode ser aplicada para avaliar diferentes doenças, sujeitas à descoberta de alvos específicos e ao desenvolvimento de radiotraçadores com boa cinética de chamadas telefônicas. A técnica também pode ser aplicada no tratamento de tumores PDL-1 positivos ao marcar o DPA com outros radionucleotídeos, como Lutécio-177 e Actínio-225. Quem demonstrará o procedimento será Wu Jiang, pesquisador do meu laboratório.
Para a radiomarcação do antagonista do peptídeo d-dodecapeptídeo, ou DPA, pipetar cinco microlitros do tampão de estoque preparado contendo DPA em um recipiente de polipropileno de 1,5 mililitro com tampa de rosca e adicionar 400 microlitros de tricloreto de gálio 68 ao recipiente. Vórtice a mistura por cinco segundos. Medir o pH da mistura utilizando tiras de teste de pH e ajustar o pH para 4 a 4,5 com hidróxido de sódio 0,1 molar.
Incubar a solução à temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. Em seguida, seguindo as condições mencionadas no texto, submeter a mistura de reação a rádio HPLC para análise do rendimento de radiomarcação. Para testar a estabilidade do traçador em PBS, adicione 10 microlitros de DPA marcado com gálio-68 em solução de acetato de sódio a 990 microlitros de PBS.
Incubar a mistura a 37 graus Celsius por uma, duas e quatro horas, com leve agitação. Recolher 200 microlitros da solução em cada ponto de tempo e analisá-la por rádio HPLC. Para testar a estabilidade do traçador no soro de camundongos, adicione 10 microlitros de DPA marcado com gálio-68 em solução de acetato de sódio a 90 microlitros do soro de camundongo recém-preparado e incube a mistura a 37 graus Celsius por uma, duas e quatro horas com leve agitação.
Em seguida, colete 20 microlitros da solução em cada ponto de tempo e adicione 100 microlitros de mistura de água aceto nitrílica na alíquota coletada. Centrifugar a mistura a 5.000 G durante 10 minutos a 25 graus Celsius. Analise o sobrenadante usando rádio HPLC.
Cultivar as células U-87 MG em placas de 12 poços até atingir 80% de confluência. Em seguida, retire o meio e lave as células com 0,5 mililitros de PBS. Diluir o DPA marcado com gálio-68 em meio fresco até uma concentração de 74 quilobecquerel por mililitro.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros do tampão DPA diluído marcado com gálio-68 a cada poço. Incubar as células com DPA marcado com gálio-68 a 37 graus Celsius pelas durações de 10, 30, 40 e 120 minutos. Após a incubação, aspirar o meio com pipeta e lavar as células com 0,5 mililitros de PBS três vezes.
Em seguida, adicione 300 microlitros de solução de hidróxido de sódio 0,5 molar por poço para lisar as células. Após 30 segundos, coletar os lisados celulares viscosos em tubos de 1,5 mililitros. Lave a placa adicionando duas vezes 0,4 mililitros de PBS por poço e colete a solução de lavagem nos tubos de 1,5 mililitro mencionados.
Ligue o computador embutido do contador gama automático e coloque os tubos na prateleira embutida. Depois de carregar todas as amostras no transportador, pressione o botão Iniciar. Os resultados são calculados no software interno, enquanto a leitura registra as contagens correlacionadas de decaimento por minuto, ou CPM, de cada tubo.
Coletar as células U-87 MG seguindo o protocolo mencionado no texto e aspirar as células em uma seringa de 0,5 mililitro. Em seguida, tome camundongos BALB/c Nude e injete as células por via subcutânea, mantendo uma contagem de dois tumores por camundongo. Monitorar o crescimento do tumor após a injeção até que o volume do tumor seja de 100 a 300 milímetros cúbicos.
Para realizar a imagem por PET, injete os traçadores por via intravenosa através de um cateter venoso caudal pré-instalado. Crie um fluxo de trabalho de digitalização em um computador host usando o software de referência, seguido pela criação de uma pasta de estudo e definição do protocolo de aquisição de acordo com as diretrizes do fabricante. Execute varreduras dinâmicas em cada mouse por 60 minutos no modo de lista 3D.
Em seguida, defina um protocolo de histograma e um protocolo de reconstrução, seguindo as instruções do fabricante. Use o filtro de Hanning com um corte de Nyquist de 0,5 ciclos por pixel para reconstruir imagens dinâmicas PET por 25 a 30 minutos e 55 a 60 minutos por meio de retroprojeção filtrada. Gere projeção de intensidade máxima, ou imagens MIP, para todos os mouses.
Administrar DPA marcado com gálio-68 aos camundongos U-87 MG com BALB/c Nude através da injeção da veia da cauda. Após a eutanásia, dissecar a parede torácica do animal e abrir o coração. Usando uma seringa de um mililitro, retire o sangue e esprema o sangue da seringa em um tubo de radioimunoensaio, ou RIA, medindo 13 milímetros de diâmetro para o contador gama.
Excise os principais órgãos e tumores e coloque-os em tubos RIA semelhantes para o contador gama. Pesar todos os principais órgãos citados no texto. Meça a radioatividade dentro dos órgãos coletados usando um contador gama automático e corrija os valores.
Calcular a percentagem de dose injectada por grama de tecido húmido. O DPA marcado com gálio-68 mostrou alta impureza de rendimento radioquímico. Foi altamente estável tanto no PBS quanto no soro de camundongos, não mostrando decomposição de gálio-68 ou hidrólise de peptídeos após quatro horas de incubação.
Aproximadamente 60% das células U-87 MG foram programadas para morte ligante um, ou PDL-1 positivo por citometria de fluxo, e a coloração imunofluorescente confirmou a forte expressão de PDL-1 nas células U-87 MG. As células U-87 MG mostraram uma captação tempo-dependente de DPA marcada com gálio-68, que reduziu significativamente com o uso de um inibidor de PDL-1, BMS-202, como agente bloqueador. A afinidade de ligação estimada para o BMS-202 foi de 43,8 nanomoles por litro quando o DPA marcado com gálio-68 foi usado como competidor.
Imagens PET de corpo inteiro revelaram alto acúmulo de DPA marcado com gálio-68 no tumor após 30 e 60 minutos da injeção. Um experimento paralelo demonstrou pouco acúmulo de DPA marcado com gálio-68 nos tumores Bon-1 de controle negativo aos 60 minutos após a injeção. Além disso, a coloração imuno-histoquímica revelou que as células MG U-87 apresentaram expressão considerável de PDL-1, mas não o tumor Bon-1.
As colorações de hematoxilina e eosina mostraram morfologia celular semelhante entre os dois tecidos tumorais. O estudo de biodistribuição ex-vivo mostrou rápida depuração de radioatividade e sangue na maioria dos órgãos analisados, incluindo coração, fígado, pulmão e músculo. O rim acumulou a maior quantidade de radioatividade, enquanto o tumor exibiu a segunda maior captação do traçador em todos os momentos.
A estrutura do peptídeo D ser diferente usando um método eficiente para marcar DPA com gálio-68 é o passo mais importante. Esta técnica abriu o caminho para explorar o teste PET como radiofármacos eficazes para gerenciar diferentes tipos de câncer, tanto como traçadores de PET quanto como agentes de diagnóstico por rádio.
